Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene in E. coli
- 作者
- Sang-Hwal Yoon, Sook-Hee Lee, Amitabha Das, Hee-Kyoung Ryu, Hee-Jeong Jang, Jae-Yean Kim, Deok-Kun Oh, Jay D. Keasling, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21), EB-NCRC and PMBBRC, Gyeongsang National University; Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University; Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2009.01.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在E. coli中构建异源甲羟戊酸(MVA)途径以增强异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)供应，提高β-胡萝卜素产量，并消除对外源添加甲羟戊酸的需求。
研究策略
将MVA途径分为上、下两部分，分别比较来自不同微生物（肺炎链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、酿酒酵母等）的途径效率，选出最优组合构建完整的嵌合MVA途径，并在不同E. coli宿主和碳源条件下优化β-胡萝卜素生产。
核心内容
该研究旨在通过在大肠杆菌中构建异源甲羟戊酸（MVA）途径，增强异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的供应，以提高β-胡萝卜素产量并摆脱对外源甲羟戊酸的依赖。研究者将MVA途径拆分为上、下两部分，分别比较来自肺炎链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和酿酒酵母等不同微生物的途径效率，筛选最优组合构建完整的嵌合途径，并在多种宿主和碳源条件下优化生产。结果显示，肺炎链球菌底部途径产量最高，48小时达141 mg/L β-胡萝卜素，较空载体对照提高3倍以上；粪肠球菌顶部途径产生的甲羟戊酸最高达29.3 mM，远高于肺炎链球菌的4.49 mM和金黄色葡萄球菌的0.49 mM。在5种宿主中，DH5α产量最高，BL21最低；以甘油为碳源时产量较葡萄糖高约9倍。最终，重组DH5α在2%甘油、120小时条件下β-胡萝卜素产量达465 mg/L，接近此前需外源添加甲羟戊酸时的最高产量503 mg/L。该研究通过组合粪肠球菌顶部途径和肺炎链球菌底部途径，实现了无需外源甲羟戊酸的β-胡萝卜素高效生产，且该平台可推广至其他萜类化合物的生物合成。
创新点
首次将不同来源的原核MVA途径上、下部分进行组合优化，获得无需外源甲羟戊酸即可高效生产β-胡萝卜素的工程菌株；发现粪肠球菌的双功能mvaE基因可避免复杂的酶表达平衡问题。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（顶部+底部） | mvaE | 双功能HMG-CoA还原酶/乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 来自粪肠球菌，用于甲羟戊酸合成，避免单独表达phaA |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（顶部） | mvaS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自粪肠球菌，与mvaE组合高效合成甲羟戊酸 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（底部） | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自肺炎链球菌，负责甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（底部） | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自肺炎链球菌 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（底部） | mvaD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 来自肺炎链球菌 |
| Escherichia coli DH5α | 异戊烯基焦磷酸代谢 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自E. coli，用于IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（顶部） | phaA | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 来自富养罗尔斯通菌，在肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌顶部构建中使用 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自成团泛菌 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自成团泛菌 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自成团泛菌 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 来自菠萝泛菌 |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，增强内源MEP途径通量 |
| Escherichia coli DH5α | β-胡萝卜素合成途径 | ipi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自雨生红球藻，在pT-DHB质粒中 |
| Escherichia coli MG1655 | β-胡萝卜素生产 | — | — | 调控 | 宿主菌株比较，产量低于DH5α |
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素生产 | — | — | 调控 | 宿主菌株比较，产量最低45 mg/L，可能因乙醛酸支路消耗乙酰-CoA |
| Escherichia coli XL1-Blue | β-胡萝卜素生产 | — | — | 调控 | 宿主菌株比较，甲羟戊酸积累最高2.5 mM但β-胡萝卜素产量仅98 mg/L |
| Escherichia coli S17-1 | β-胡萝卜素生产 | — | — | 调控 | 宿主菌株比较，产量介于中间 |
关键发现
- 在比较底部MVA途径时，肺炎链球菌的底部途径产量最高，达141 mg/Lβ-胡萝卜素（48 h），较空载体对照提高3倍以上
- 顶部MVA途径中，粪肠球菌的mvaE/mvaS组合产生最高甲羟戊酸29.3 mM（48 h），远高于肺炎链球菌的4.49 mM和金黄色葡萄球菌的0.49 mM
- 在5种E. coli宿主中，DH5α产量最高（141 mg/L），BL21最低（45 mg/L）
- 以甘油为碳源时产量显著优于葡萄糖（16 mg/L），相差约9倍
- 最终在2%甘油、120 h培养条件下，重组E. coli DH5α（pS-NA + pT-DHB）的β-胡萝卜素产量达465 mg/L（正文中为464 mg/L），接近先前需外源添加甲羟戊酸时的最高产量503 mg/L。
研究结论
通过组合粪肠球菌顶部MVA途径和肺炎链球菌底部MVA途径构建的完整嵌合MVA途径，可在E. coli中实现无需外源甲羟戊酸的β-胡萝卜素高效生产，且该平台可推广至其他萜类化合物的生物合成。