Efficient in vitro synthesis of cis-polyisoprenes using a thermostable cis-prenyltransferase from a hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis
- 作者
- Yosuke Yamada, Wakao Fukuda, Kazutake Hirooka, Takeshi Hiromoto, Jun-ichi Nakayama, Tadayuki Imanaka, Ei-ichiro Fukusaki, Shinsuke Fujiwara
- 单位
- Department of Bioscience, Nanobiotechnology Research Center, School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University; Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University; Research Center for Near Infrared Spectroscopy, Graduate School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University; Laboratory for Chromatin Dynamics, Center for Developmental Biology, RIKEN; Department of Biotechnology, College of Life Sciences, Ritsumeikan University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2009.06.026
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用热稳定的顺式异戊烯基转移酶在体外高效合成不同链长的顺式聚异戊二烯，并提高产物回收率和酶稳定性。
研究策略
从超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensis中克隆顺式异戊烯基转移酶基因Tk-idsB，在大肠杆菌中重组表达纯化；通过CD光谱和动力学表征酶学性质；基于同源结构模型设计定点突变改变产物链长；采用有机-水双液相系统促进疏水性产物萃取；通过硅珠固定化提高酶热稳定性。
核心内容
该研究从超嗜热古菌Thermococcus kodakaraensis中克隆了顺式异戊烯基转移酶基因Tk-idsB，并在大肠杆菌中重组表达纯化。酶学表征显示Tk-IdsB具有极高热稳定性，96°C下仍未完全变性，最适温度为60-70°C，最适pH 8.5，以GPP和FPP为优选引发底物，其催化效率（kcat/Km为1500 s⁻¹μM⁻¹）远高于同类型酶。野生型酶的主要产物为C60-C65顺式聚异戊二烯。通过基于同源结构模型的定点突变，成功将产物主链延长至C65-C70。在有机-水双液相系统中，选用1-戊醇或1-丁醇覆盖时，超过90%的产物可从有机相高效回收，且有机溶剂的疏水性可改变产物链长分布。将酶固定化于硅珠后，80°C下半衰期从46分钟延长至156分钟，且在双液相系统中催化效率优于游离酶。该工作表明，结合超嗜热酶、蛋白工程和双液相反应体系，可体外高效合成不同链长的顺式聚异戊二烯，为相关化学和制药应用提供了可行的酶法合成策略。
创新点
['首次报道超嗜热古菌T. kodakaraensis来源的顺式异戊烯基转移酶Tk-IdsB的酶学特性', '基于结构模型中的vent-like疏水 cleft 设计单点突变，成功将产物链长从C60-C65延长至C65-C70', '将有机-水双液相系统应用于顺式聚异戊二烯的体外合成，实现产物高效回收', '通过固定化将酶在80°C的半衰期从46分钟延长至156分钟']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermococcus kodakaraensis KOD1 | 顺式聚异戊二烯生物合成途径 | TK1173 (Tk-idsB) | Tk-IdsB | 催化 | 野生型基因来源，天然催化IPP与烯丙基二磷酸的顺式缩合 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL | 重组蛋白表达 | Tk-idsB | Tk-IdsB | 催化 | 重组表达并纯化，用于体外酶学表征和合成应用 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL | 定点突变 | Tk-idsB-E68A | Tk-IdsB-E68A | 催化 | Glu68突变为Ala，产物链长延长至C65-C70 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL | 定点突变 | Tk-idsB-K109A | Tk-IdsB-K109A | 催化 | Lys109突变为Ala，产物链长延长最显著，并增加>C70产物比例 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL | 定点突变 | Tk-idsB-L113A | Tk-IdsB-L113A | 催化 | Leu113突变为Ala，产物链长延长至C65-C70 |
关键发现
- ['Tk-IdsB在96°C下仍未完全变性，具有极高热稳定性', 'Tk-IdsB最适pH
- 5，最适温度60-70°C，偏好GPP和FPP作为引发底物，对DMAPP活性较低', '动力学参数：以GPP为底物时k0/Km为1500 s^-1 μM^-1，为已报道cis-异戊烯基转移酶中最高（E. coli UPP合酶为0.61 s^-1 μM^-1，M. tuberculosis UPP合酶为62 s^-1 μM^-1）', '野生型Tk-IdsB产物分布（C15-C90）：>C75占11.5%，C65-C70占60.7%，C55-C60占17.4%，C45-C50占3.3%，C30-C40占3.9%，<C25占3.2%，主要产物为C60-C65', '单点突变E68A、K109A、L113A均使主要产物变为C65-C70，其中K109A还能增加>C70产物的比例', '双液相系统中，1-丁醇或1-戊醇覆盖时超过90%的产物从有机相回收，1-辛醇覆盖时70%产物从有机相回收', '双液相系统中产物分布受有机溶剂疏水性影响：1-辛醇时主产物为C55-C60（占有机相产物52.4%），1-戊醇时主产物为C30-C40（占49.6%），1-丁醇时主产物为C60-C65', '固定化后约54%的蛋白结合到硅珠上（0.87 mg from
- 62 mg），比活性从1.89 nmol min^-1 μg^-1降至2.10×10^-2 nmol min^-1 μg^-1，但80°C下半衰期从46分钟延长至156分钟', '在双液相系统中，固定化Tk-IdsB的催化效率高于未固定化形式']
研究结论
本研究证明Tk-IdsB是一种高活性、高热稳定性的顺式异戊烯基转移酶，通过定点突变和有机-水双液相系统可调控产物链长并提高合成效率，固定化可进一步增强其稳定性。该策略为体外高效合成各种链长的顺式聚异戊二烯提供了可行方案，所得产物有望应用于化学和制药领域。