An efficient bioprocess for enzymatic production of L-menthol with high ratio of substrate to catalyst using whole cells of recombinant E. coli
- 作者
- Gao-Wei Zheng, Jiang Pan, Hui-Lei Yu, Minh-Thu Ngo-Thi, Chun-Xiu Li, Jian-He Xu
- 单位
- 华东理工大学，生物反应器工程国家重点实验室，生物催化与生物加工实验室；上海市梅陇路130号，上海200237，中国
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2010.07.007
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统生物催化生产L-薄荷醇过程中，催化剂用量大（底物与催化剂比S/C低，仅2），高催化剂负载导致严重乳化、产物回收困难、生产成本高；需要开发高效、高底物负载、高S/C比的生物催化工艺。
研究策略
从Bacillus subtilis ECU0554中克隆酯酶基因，并在E. coli BL21(DE3)中过表达；以重组大肠杆菌全细胞为催化剂，进行DL-薄荷醇乙酸酯的动力学拆分；优化共溶剂（乙醇）浓度、催化剂负载和底物负载等关键参数；并将优化工艺放大至2-L规模。
核心内容
该研究构建了高效生物催化生产L-薄荷醇的新工艺。研究者从Bacillus subtilis ECU0554中克隆酯酶基因，在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达获得重组全细胞催化剂，用于DL-薄荷醇乙酸酯的动力学拆分。重组酯酶recBsE对底物表现出优异对映选择性（E>100），其全细胞催化剂半衰期达32.4 h，是游离酶的11倍。通过优化乙醇浓度、催化剂及底物负载等参数，底物负载提高至200 g/L，催化剂负载降至2.5 g/L，底物与催化剂比（S/C）从野生型的2提升至80，催化剂产率提高75倍达27 g/g，时空产率达202 g/L/d，产物对映体过量经重结晶后超过99%。同时有效避免了乳化问题，产物分离时间从60分钟以上缩短至不足1分钟。2-L规模放大反应在8小时内获得43%分离收率，一次重结晶得60 g L-薄荷醇（ee>99%）。该工艺实现了高底物负载、高S/C比的高效生产，具有明确的工业应用前景。
创新点
1. 首次实现了B. subtilis酯酶在大肠杆菌中的高效表达，重组全细胞催化剂稳定性显著提高（半衰期提高11倍）；2. 通过优化，S/C比从2提高至50（未优化）和80（优化后），比野生型过程提高40倍；3. 底物负载提高至200 g/L（约1M），催化剂负载降至2.5 g/L，时空产率从54提高至202 g/L/d，催化剂产率提高75倍；4. 有效防止乳化，产物分离时间从>60 min缩短至<1 min，分离收率提高2倍。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | DL-薄荷醇乙酸酯动力学拆分 | 酯酶基因（GenBank BSU34390） | 重组酯酶recBsE | 催化 | 重组全细胞催化剂，用于生产L-薄荷醇 |
| Bacillus subtilis ECU0554 | DL-薄荷醇乙酸酯动力学拆分 | 酯酶基因（BsE） | 野生型酯酶BsE | 催化 | 基因来源及第一代全细胞催化剂对照 |
关键发现
重组酯酶recBsE对DL-薄荷醇乙酸酯表现出最佳对映选择性（E>100），而对丙酸酯和丁酸酯分别为44和32。全细胞催化剂的半衰期（32.4 h）是游离酶（2.8 h）的11倍。在未优化条件下，重组全细胞催化剂仅需2.0 g/L即可转化40%底物（100 g/L），S/C比为50，而野生型B. subtilis需50 g/L催化剂且S/C比仅2，催化剂产率由0.36 g/g提高到15 g/g（提高40倍）。进一步优化后，底物负载达200 g/L，催化剂负载仅2.5 g/L，S/C比达80，转化率45%，产物对映体过量（ee_p）为95%（重结晶后>99%），时空产率202 g/L/d，催化剂产率27 g/g（较野生型提高75倍）。2-L放大反应在8 h内获得43%分离收率，产物经一次重结晶得60 g L-薄荷醇，ee>99%。加入10%乙醇使E值从31提高到>100，底物转化率从40%提高到48%。
研究结论
开发了利用重组大肠杆菌全细胞高效生产L-薄荷醇的生物催化工艺，实现了高底物负载（200 g/L）和高S/C比（80），避免了乳化问题，提高了产物回收率，该工艺技术高效、环境友好，具有工业应用潜力。