Bioconversion of ginsenosides Rb1, Rb2, Rc and Rd by novel β-glucosidase hydrolyzing outer 3-O glycoside from Sphingomonas sp. 2F2: Cloning, expression, and enzyme characterization
- 作者
- Liang Wang, Qing-Mei Liu, Bong-Hyun Sung, Dong-Shan An, Hyung-Gwan Lee, Song-Gun Kim, Sun-Chang Kim, Sung-Taik Lee, Wan-Taek Im
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon 305-701, Republic of Korea; Industrial Biotechnology & Bioenergy Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon 305-806, Republic of Korea; Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon 305-805, Republic of Korea; KAIST Institute for Biocntry, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon 305-701, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2011.07.024
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大分子人参皂苷难以被人体直接吸收，需要转化为稀有皂苷；但传统转化方法效率低、副产物多。因此需要寻找能高效、选择性水解人参皂苷糖基的酶。
研究策略
从人参种植土壤中分离具有人参皂苷水解活性的Sphingomonas sp. 2F2，构建fosmid文库筛选β-葡萄糖苷酶基因bglSp，在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达，通过Amylose亲和层析和DEAE-纤维素层析纯化重组酶，进行酶学表征和底物选择性分析，并利用TLC和HPLC研究其对四种主要人参皂苷的转化路径。
核心内容
从人参种植土壤中筛选到一株具有人参皂苷水解活性的Sphingomonas sp. 2F2，通过构建fosmid文库克隆得到β-葡萄糖苷酶基因bglSp，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。重组酶BglSp属于糖苷水解酶家族1，经亲和层析和DEAE-纤维素层析纯化后，其最适pH为5.0，最适温度为37°C，对pNP-β-D-葡萄糖苷的Km为2.9 mM，Vmax为515.4 μmol/min/mg。该酶展现出严格的C-3位外侧葡萄糖选择性：可将Rb1在30分钟内完全转化为稀有皂苷Gyp XVII，Rd在12小时内完全转化为F2，Rb2和Rc在2小时内分别生成C-O和C-Mc1，且长时间反应仅产生微量F2副产物。这是首次报道能选择性水解人参皂苷C-3位外侧葡萄糖的家族1β-葡萄糖苷酶，为高效制备高活性稀有皂苷提供了理想的酶工具，解决了传统转化方法效率低、副产物多的问题，具有重要的工业化应用潜力。
创新点
首次报道一种来自Sphingomonas sp. 2F2的β-葡萄糖苷酶（BglSp），属于糖苷水解酶家族1，能选择性水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的C-3位外侧葡萄糖，分别生成稀有皂苷Gyp XVII、C-O、C-Mc1和F2，避免了非特异水解导致的复杂产物。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sphingomonas sp. 2F2 | 人参皂苷水解 | bglSp | BglSp (β-葡萄糖苷酶) | 催化 | 从人参种植土壤中分离的菌株，提供bglSp基因，该酶催化水解C-3位外侧葡萄糖 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | bglSp | BglSp (重组β-葡萄糖苷酶) | 催化 | 用于重组表达和酶纯化的宿主，MBP融合表达后经TEV蛋白酶切除标签 |
关键发现
- bglSp基因全长1344 bp，编码447个氨基酸，预测分子量为49,399 Da；重组BglSp对pNP-β-D-葡萄糖苷的Km为2.9±0.3 mM，Vmax为515.4±38.3 μmol/min/mg；最适pH为5.0，最适温度为37°C；在pH
- 0时活性下降80%，pH
- 0时下降60%；SDS完全抑制活性，1 mM Hg2+相对活性26.8%，10 mM Hg2+相对活性2.4%，10 mM Cu2+使活性下降55%；Mn2+有轻微促进作用；活性对底物pNP-β-D-岩藻糖苷为100.6%，pNP-β-D-葡萄糖苷为100%，对pNP-β-D-半乳糖苷为61.1%；Rb1在30分钟内完全转化为Gyp XVII，长时间后微量生成F2；Rd在12小时内完全转化为F2；Rb2和Rc在2小时内分别生成C-O和C-Mc1，长时间后仅微量生成F2。
研究结论
BglSp是第一个能选择性水解人参皂苷C-3位外侧葡萄糖的家族1β-葡萄糖苷酶，可高效转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd为稀有皂苷Gyp XVII、C-O、C-Mc1和F2，为工业化制备高活性稀有皂苷提供了有效酶工具。