Exploring novel bacterial terpene synthases
- 作者
- Gajendar Komati Reddy, Nicole G. H. Leferink, Maiko Umemura, Syed T. Ahmed, Rainer Breitling, Nigel S. Scrutton, Eriko Takano
- 单位
- Manchester Synthetic Biology Research Centre SYNBIOCHEM, Manchester Institute of Biotechnology, School of Chemistry, University of Manchester, Manchester, England, United Kingdom; Future Biomafacturing Research Hub (FBRH), Manchester Institute of Biotechnology, School of Chemistry, University of Manchester, Manchester, England, United Kingdom; Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki, Japan; AIST-Waseda University Computational Bio Big-Data Open Innovation Laboratory (CBBD-OIL), AIST, Tsukuba, Ibaraki, Japan
- 杂志
- PLoS ONE（2020）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0232220
- 所属领域
- 合成生物学 / 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
细菌基因组中存在大量功能未知的推定萜烯合酶，缺乏对其催化活性和底物杂泛性的系统表征。
研究策略
基于HMM搜索从73,714个细菌蛋白中挖掘类Ⅰ萜烯合酶，构建含2,167个序列的邻接树，挑选22个代表性基因在E. coli中异源表达并纯化，以GPP、FPP和GGPP为底物进行体外和体内活性筛选，结合GC-QToF鉴定产物结构。
核心内容
该研究系统发掘了细菌基因组中功能未知的推定萜烯合酶。作者基于HMM搜索从73,714个细菌蛋白中鉴定出2,167个类Ⅰ萜烯合酶/环化酶，构建邻接树后挑选22个代表性基因，在E. coli中异源表达并纯化，以GPP、FPP和GGPP为底物进行体内外活性筛选，结合GC-QToF鉴定产物。结果显示15个酶具有催化活性，包括7个倍半萜合酶、3个二萜合酶和5个兼具单萜/倍半萜合酶活性的酶，表明底物杂泛性在细菌萜烯合酶中普遍存在。多个倍半萜合酶可接受GPP生成单萜，提示细菌单萜合酶潜力被低估。研究首次报道了细菌来源的longiborneol合酶（来自Burkholderia paludis），以及细菌中未曾报道的aromandendrene、acora-3,7(14)-diene和longiborneol产物。此外，来自耐辐射耐热菌Rubrobacter radiotolerans的RrNerS和RrBerS在60°C仍保有活性。通过共表达异源MVA途径并结合ispAM22突变体建立体内二萜筛选平台，使二萜产量提高10倍。这些发现为萜类生物合成途径工程提供了丰富的耐热及杂泛性酶资源。
创新点
['系统发掘细菌萜烯合酶多样性，发现15个具有活性的新萜烯合酶。', '发现多个倍半萜合酶同时具有单萜合酶活性，表明细菌单萜合酶潜力被低估。', '首次报道细菌来源的longiborneol合酶，以及细菌中未曾报道的aromandendrene、acora-3,7(14)-diene和longiborneol产物。', '利用ispAM22突变体和异源MVA途径建立体内二萜筛选平台，使二萜产量提高10倍。', '发现来自耐辐射耐热菌Rubrobacter radiotolerans的耐热萜烯合酶，可在60°C下保持活性。']
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)/ArcticExpress(DE3) | 异源甲羟戊酸(MVA)途径 | pMVA | MVA途径酶 | 催化 | 共表达以增强IPP/DMAPP前体供给 |
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成 | ispA (ispAM22突变体, D2G/C155G) | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (GGPP synthase) | 催化 | 使FPP合酶转变为GGPP合酶，体内提供C20底物 |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | AHY47823.1 | RrNerS (linalool/nerolidol synthase) | 催化 | 来自Rubrobacter radiotolerans；FPP→trans-nerolidol，GPP→R/S-linalool |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | AHY45426.1 | RrBerS (α-bergamotene synthase) | 催化 | 来自Rubrobacter radiotolerans；FPP→α-bergamotene，GPP→linalool |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | KYF56472.1 | ScAroS (aromandendrene synthase) | 催化 | 来自Sorangium cellulosum；FPP→aromandendrene，GPP→ocimene/β-pinene/linalool |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | KFG92939.1 | BpLonS (longiborneol synthase) | 催化 | 来自Burkholderia paludis；FPP→(±)-cadinene和longiborneol，首个细菌longiborneol合酶 |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | AHH94051.1 | KaGerS (germacrene D/germacradienol synthase) | 催化 | 来自Kutzneria albida DSM 43870；FPP→germacrene D和germacradienol |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | KPH97530.1 | AbAcoS (acora-3,7(14)-diene synthase) | 催化 | 来自Actinobacteria bacterium OV450；FPP→copaene和acora-3,7(14)-diene |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | ADU09376.1 | MiGerS (germacratriene synthase) | 催化 | 来自Micromonospora sp. L5；FPP→germacrene A和1(10),4,11-germacratriene |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | CAN96536.1 | ScEpiS (10-epi-cubebol synthase) | 催化 | 来自Sorangium cellulosum So ce56；GPP→cis/trans-β-ocimene和linalool，FPP→多种cadinane型倍半萜 |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | CAB41566.1 | ScGeoS (geosmin synthase) | 催化 | 来自Streptomyces coelicolor A3(2)；FPP→geosmin/germacradienol/germacrene D，GPP→myrcene/ocimene/linalool/geraniol |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | ACY98649.1 | TcCubS (cubebol synthase) | 催化 | 来自Thermomonospora curvata DSM 43183；FPP→cubebol |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | EXG82599.1 | CaCubS (cubebol synthase) | 催化 | 来自Cryptosporangium arvum DSM 44712；FPP→cubebol |
| Escherichia coli (BL21/ArcticExpress用于体外，DH5α/BL21用于体内) | 萜类生物合成 | ELQ82238.1 | SrGuaS (guaia-1(10),11-diene synthase) | 催化 | 来自Streptomyces rimosus；FPP→guaia-1(10),11-diene和(+)-γ-gurjunene |
| Escherichia coli DH5α (体内/ispAM22) | 二萜生物合成 | ABU58787.1 | RcDTPS (diterpene synthase) | 催化 | 来自Roseiflexus castenholzii DSM 13941；GGPP→2-3个未鉴定二萜化合物 |
| Escherichia coli DH5α (体内/ispAM22) | 二萜生物合成 | EJL71407.1 | CsDTPS (diterpene synthase) | 催化 | 来自Chryseobacterium sp. CF314；GGPP→2个未鉴定二萜化合物 |
| Escherichia coli DH5α (体内/ispAM22) | 二萜生物合成 | KFE96946.1 | CIDTPS (diterpene synthase) | 催化 | 来自Chryseobacterium luteum；GGPP→2-3个未鉴定二萜化合物 |
关键发现
- 从73,714个细菌蛋白中鉴定出2,167个推定萜烯合酶/环化酶
- 挑选的22个代表性TS中有15个检测到活性，包括7个倍半萜合酶、3个二萜合酶和5个兼具单萜/倍半萜合酶活性的酶
- 多个倍半萜合酶表现出底物杂泛性，可接受GPP并生成单萜
- 新发现的细菌萜类产物包括aromandendrene、acora-3,7(14)-diene和longiborneol
- 首次鉴定细菌longiborneol合酶（来自Burkholderia paludis）
- 来自Rubrobacter radiotolerans的RrNerS和RrBerS在60°C仍具有活性
- 共表达异源MVA途径使二萜产量提高10倍。
研究结论
细菌是萜烯合酶的重要来源，底物杂泛性在细菌萜烯合酶中普遍存在；新发现的耐热和杂泛性酶为萜类生物合成途径工程提供了丰富资源。