Subcellular compartmentalization in protoplasts from Artemisia annua cell cultures: Engineering attempts using a modified SNARE protein
- 作者
- Gian Pietro Di Sansebastiano, Francesca Rizzello, Miriana Durante, Sofia Caretto, Rossella Nisi, Angelo De Paolis, Marianna Faraco, Anna Montefusco, Gabriella Piro, Giovanni Mita
- 单位
- DiSteBA (Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche ed Ambientali), University of Salento, Campus ECOTEKNE, 73100 Lecce, Italy; CNR - ISPA (Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari), Via Monteroni, 73100 Lecce, Italy; DII (Dipartimento di Ingegneria dell'Innovazione), University of Salento, Campus ECOTEKNE, 73100 Lecce, Italy
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2014.11.016
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物细胞区室化机制理解不足，导致重组蛋白和次生代谢产物过量生产失败；青蒿素在黄花蒿中天然积累于腺毛质外体，依赖自噬和非经典分泌，在悬浮细胞中难以实现稳定积累，需要通过对内膜系统进行工程改造来捕获并稳定目标代谢物。
研究策略
利用黄花蒿悬浮细胞原生质体作为研究体系，表征亚细胞区室化；使用缺失N-末端的AtSYP51截短形式51H3诱导人工区室，该区室连接胞吐和内吞途径，可稳定液泡蛋白并提高其活性，从而为青蒿素积累提供新途径。
核心内容
该研究以黄花蒿G6悬浮细胞来源的原生质体为体系，探索通过改造内膜系统实现“区室化工程”的策略，以期为青蒿素等代谢物的稳定积累提供新途径。研究者首先建立了转化效率约50%以上的高效原生质体转化体系，并系统表征了多种内膜区室标记。通过表达拟南芥SNARE蛋白AtSYP51的不同截短形式，发现全长51F会干扰液泡运输使标记滞留于小液泡，截短变体51T加速标记到达中央液泡，而N端缺失的51H3则诱导形成由内吞和内质网到液泡运输膜共同贡献的稳定人工区室。该区室不与高尔基标记共定位，仅与PVC标记部分重叠。共表达51H3使液泡标记酶RGUSChi的总活性平均提高约35%，且不影响分泌型酶活性，表明该人工区室能稳定液泡蛋白并提升其活性。这项工作首次在黄花蒿体系中证明SNARE突变体可有效重塑细胞内膜系统，为在不依赖腺毛的情况下于营养细胞中积累青蒿素提供了“区室化工程”的新思路。
创新点
['首次在黄花蒿悬浮细胞原生质体中系统性表征了多种细胞内膜区室标记', '发现截短的SNARE蛋白51H3能诱导一个由内吞和内质网到液泡运输膜共同贡献的稳定人工区室', '证明51H3可提高液泡标记酶RGUSChi的总活性约35%，为植物细胞区室化工程提供了可行工具', "提出'区室化工程'策略，区别于传统代谢酶过表达和毛状体密度改良"]
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua L. G6细胞悬浮培养来源的原生质体 | 青蒿素生物合成 | AtSYP51 | SYP51 | 调控 | Qc-SNARE蛋白，调控液泡蛋白分选和运输；其截短形式51H3诱导人工区室 |
| Artemisia annua L. G6细胞悬浮培养来源的原生质体 | 液泡运输 | AtSYP51 | 51H3 | 调控 | AtSYP51缺失N-末端的截短形式，诱导由内吞和内质网到液泡运输膜形成的人工区室，增加液泡蛋白稳定性 |
| Artemisia annua L. G6细胞悬浮培养来源的原生质体 | 液泡运输 | AtSYP51 | 51T | 调控 | C-末端截短形式，加速GFPg1133Chi标记中央液泡 |
| Artemisia annua L. G6细胞悬浮培养来源的原生质体 | 液泡运输 | AtSYP51 | 51F | 调控 | AtSYP51全长形式，干扰液泡运输，使标记滞留小液泡 |
| Artemisia annua L. G6细胞悬浮培养来源的原生质体 | 液泡运输 | RGUSChi | RGUSChi | 催化 | 含液泡分选信号的大鼠β-葡萄糖醛酸酶，作为液泡蛋白稳定性报告酶 |
关键发现
- 建立了黄花蒿G6悬浮细胞原生质体高效转化体系，转化效率约50%或以上
- GFPg1133Chi显示液泡分选为间接途径，先进入小液泡再融合至中央液泡
- AtSYP51截短变体51T加速液泡标记到达中央液泡，全长51F干扰液泡运输使标记滞留小液泡，而51H3显著增加液泡荧光并诱导形成异常区室
- 共表达51H3使液泡标记酶RGUSChi总活性平均增加35%（n=3），而对分泌型secRGUS活性无促进
- 51H3诱导的区室不与高尔基标记ST52-mRFP共定位，但与PVC标记Cherry:Bp80部分共定位。
研究结论
截短的SNARE蛋白51H3通过诱导连接胞吐与内吞途径的人工区室，能够稳定液泡蛋白并提高其活性，表明通过SNARE突变体改造植物细胞内膜系统是可行的'区室化工程'策略，为在黄花蒿营养细胞中积累青蒿素等代谢物提供了新的思路。