高级醇 · 代谢工程文献库

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Whole-cell double oxidation of n-heptane

作者
Christina A. Müller, Alexander Dennig, Tim Welters, Till Winkler, Anna Joelle Ruff, Werner Hummel, Harald Gröger, Ulrich Schwaneberg
单位
Institute of Biotechnology, RWTH Aachen; Institute of Molecular Enzyme Technology at the Heinrich-Heine-University of Düsseldorf, Research Centre Jülich; Faculty of Chemistry, Bielefeld University
杂志
Journal of Biotechnology（2014）
DOI
10.1016/j.jbiotec.2014.06.001
所属领域
代谢工程
关键词
Cascade reactionalcohol dehydrogenasealkanesdirected evolutiondouble oxidationmonooxygenase
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解决的核心问题

开发全细胞双氧化正庚烷合成手性醇和庚酮的工艺，克服体外酶催化中辅因子再生和成本高的问题

研究策略

通过人工操纵子共表达P450 BM3单加氧酶和醇脱氢酶（RE-ADH/Lb-ADH），以静息E. coli细胞为催化剂，在双液相体系中以正庚烷为底物，利用葡萄糖氧化驱动辅因子再生

研究路线图

100%
研究问题：开发全细胞双氧化正庚烷工艺，克服体外酶催化辅因子再生与成本瓶颈
策略：人工操纵子共表达P450 BM3与ADH，静息E. coli全细胞催化双液相氧化
关键改造①：PLICing构建单多顺反子mRNA共表达系统（含双RBS）
关键改造②：耦合E. coli葡萄糖氧化驱动NAD(P)H再生
关键改造③：引入RE-ADH/Lb-ADH，实现手性选择性及完全庚酮氧化
结果：产物5.7mM（3倍体外），P450表达81mg/g CDW，ee>99%，TTN=2930，庚酮选择性>99%
结论：人工操纵子全细胞双氧化系统高效工业可行，可调选择性与氧化度
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核心内容

该研究以静息态大肠杆菌为全细胞催化剂，通过人工操纵子共表达P450 BM3单加氧酶与来自红球菌或短乳杆菌的醇脱氢酶，在双液相体系中实现正庚烷的双氧化，分别合成手性庚醇或庚酮。人工操纵子采用单多顺反子mRNA设计，降低了代谢负担，使P450 BM3 CM1NADH表达量达81 mg g⁻¹ CDW，细胞生长速率较双质粒系统提高2倍，生物量翻倍。在优化条件下，产物总浓度达5.7 mM（656 mg L⁻¹），为体外系统的3倍，其中(S)-3-庚醇的对映体过量值超过99%。当引入Lb-ADH后，正庚烷几乎完全氧化为庚酮，选择性超过99%，两酶系统总周转数为2930。该全细胞体系借助葡萄糖氧化驱动辅因子再生，产物浓度和酶表达量均优于体外系统，且通过更换醇脱氢酶可灵活调控产物立体选择性与氧化程度，为工业应用提供了成本有效的替代方案。

创新点

首次实现全细胞双氧化正庚烷；设计人工操纵子（单多顺反子mRNA）共表达两种酶，降低代谢负担并提高表达量；耦合E. coli葡萄糖氧化增强辅因子再生；引入第二条醇脱氢酶实现庚醇完全氧化为庚酮

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) Gold lacI^Q1 正庚烷双氧化 CYP102A1 P450 BM3（变体CM1NADH、WTNADH、19A12NADH等） 催化 来自Bacillus megaterium；催化正庚烷羟基化生成庚醇
Escherichia coli 正庚烷双氧化/醇氧化 RE-ADH基因 RE-ADH（来自Rhodococcus erythropolis） 催化 (S)-选择性醇脱氢酶；氧化庚醇为庚酮
Escherichia coli 正庚烷双氧化/醇氧化 Lb-ADH基因 Lb-ADH（来自Lactobacillus brevis） 催化 (R)-选择性醇脱氢酶，NADPH依赖；用于实现庚醇完全氧化为庚酮
Escherichia coli 辅因子再生（葡萄糖氧化） — — 能量供给 利用宿主内源葡萄糖代谢再生NAD(P)H
Escherichia coli 基因表达调控 人工操纵子（含两个RBS） — 调控 通过PLICing构建的多顺反子表达系统，单mRNA实现P450和ADH的共表达

关键发现

  1. 人工操纵子共表达系统使P450 BM3 CM1NADH表达量达81 mg g^-1 CDW
  2. 在优化条件下产物总浓度为5.7 mM (656 mg L^-1)，是体外系统的3倍
  3. 对于(S)-3-庚醇，ee值>99%
  4. P450 BM3 19A12与Lb-ADH两酶系统的总周转数(TTN)为2930
  5. 加入第二个醇脱氢酶（Lb-ADH）后，正庚烷几乎完全氧化为庚酮，选择性>99%
  6. 相比2-质粒系统，人工操纵子系统生长速率提高2倍，生物量翻倍

研究结论

全细胞双氧化系统通过人工操纵子共表达策略实现了高效的正庚烷氧化，产物浓度和P450表达量均优于体外系统，并且可通过添加不同的醇脱氢酶调节产物的立体选择性和氧化程度，是工业应用中有前景且成本有效的替代方案