\(\Delta^9\) -Tetrahydrocannabinol acid synthase production in Pichia pastoris enables chemical synthesis of cannabinoids
- 作者
- Kerstin Lange, Andreas Schmid, Mattijs K. Julsing
- 单位
- Laboratory of Chemical Biotechnology, Department of Biochemical & Chemical Engineering, TU Dortmund University, Dortmund, Germany; Department of Solar Materials, Helmholtz Centre for Environmental Research (UFZ), Leipzig, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2015.06.425
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
THCAS作为植物源复杂酶，在异源宿主中表达量低、活性不足，无法满足生物催化剂在化学合成THC中的应用需求。
研究策略
选择毕赤酵母P. pastoris KM71 KE1作为生产宿主，通过密码子优化、信号肽替换(α-交配因子)实现THCAS分泌表达；进行2 L补料分批发酵放大；采用透析和阳离子交换层析纯化；利用有机/水两液相系统进行底物供给和产物原位移除。
核心内容
该研究在毕赤酵母中实现了大麻素生物合成关键酶Δ9-四氢大麻酚酸合酶（THCAS）的高效分泌表达，以解决该植物源酶在异源宿主中表达量低、活性不足的问题。通过密码子优化和α-交配因子信号肽替换，在2 L补料分批发酵中，最终生物量达93 g_CDW/L，总蛋白472 mg/L，总活性2 U，最大比活9.2 U/g总蛋白。经透析和阳离子交换层析纯化后，活性组分比活最高达72.9 U/g总蛋白，较此前报道提高33倍，估算THCAS产量约5-10 mg/L。在摇瓶培养中，150 μM底物CBGA可转化为20 μM THCA（约15%转化率）。为解决产物抑制和酶失活问题，研究建立有机/水两液相反应体系，使酶活性从水相中的20分钟失活延长至3小时以上稳定，最终实现毫克级THCA合成。该策略证明毕赤酵母分泌表达结合两液相反应可有效催化复杂疏水性天然产物的生物合成，为其他植物源酶的异源应用提供了可行思路。
创新点
首次在P. pastoris中实现THCAS的高效分泌生产，比活性较此前报道提高33倍；建立两液相反应体系，使酶活性从20分钟延长至3小时以上；实现毫克级THCA合成。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris KM71 KE1 (Mut^S) | 大麻素生物合成途径（THCA合成） | thcas（密码子优化的，GenBank AB057805） | Δ9-四氢大麻酚酸合酶（THCAS） | 催化 | 黄素依赖性氧化酶，催化CBGA氧化环化生成THCA；通过α-交配因子信号肽分泌；在2 L发酵罐中最高比活9.2 U/g总蛋白，纯化后最高73 U/g |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 大麻素生物合成途径 | thcas（pET15b-THCAS-S） | THCAS（包涵体） | 催化 | 表达但无活性，形成包涵体；复性失败 |
| Saccharomyces cerevisiae（信号肽来源） | 分泌途径 | MFα1（α-交配因子信号肽） | α-交配因子信号肽 | 转运 | 替换THCAS天然信号肽，促进其在P. pastoris中的分泌 |
| Pichia pastoris KM71 KE1 | 甲醇同化途径 | AOX1（敲除） | 醇氧化酶1（AOX1） | 催化 | 敲除AOX1产生Mut^S表型，AOX2为唯一醇氧化酶；减少与THCAS竞争FAD |
关键发现
- 在2 L发酵罐中，THCAS生产最终生物量达93 g_CDW/L，总蛋白472 mg/L，总活性2 U，最大比活9.2 U/g总蛋白（41.5 h），90 h后为3.3 U/g
- 纯化后活性组分1比活72.9 U/g总蛋白（12.7倍富集），组分2比活43.9 U/g（7.7倍富集）
- 估算THCAS占活性组分总蛋白30%，产量约5-10 mg/L
- 摇瓶培养中150 μM CBGA生成20 μM THCA（15%转化）
- 两液相体系中比活1.5 U/g总蛋白，但活性稳定超过3 h，而水相中20 min内失活。
研究结论
本文实现了THCAS在P. pastoris中的高效分泌表达（比活性较文献提高33倍），通过简单纯化获得活性酶，并利用有机/水两液相反应系统使酶活性稳定3小时以上，成功进行了毫克级THCA合成，证明该策略可用于复杂疏水性天然产物的生物催化合成。