Screening for improved isoprenoid biosynthesis in microorganisms
- 作者
- Anita Emmerstorfer-Augustin, Sandra Moser, Harald Pichler
- 单位
- ACIB - Austrian Centre of Industrial Biotechnology, Petersgasse 14, 8010 Graz, Austria; Institute of Molecular Biotechnology, NAWI Graz, Graz University of Technology, Petersgasse 14, 8010 Graz, Austria
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2016.03.051
- 所属领域
- 代谢工程, 合成生物学
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解决的核心问题
异戊二烯类化合物在重组微生物中的生产受限于缺乏高通量、直接的筛选方法，难以高效筛选改进的菌株或酶，尤其是这些化合物常具有不溶性、挥发性和毒性等特点。
研究策略
系统综述了现有筛选策略，包括基于类胡萝卜素色素、荧光检测、副产物颜色反应、生长选择、生物传感器等方法，并分析了各方法的适用性、优缺点及在定向进化和代谢工程中的应用。
核心内容
该论文系统评述了微生物异戊二烯类化合物生物合成中用于筛选高产菌株和改良酶的策略，重点聚焦于直接或间接的表型检测方法。作者将现有方法归为类胡萝卜素色素报告、荧光检测、副产物颜色反应、生长选择及代谢物生物传感器等类别，并结合定向进化和代谢工程中的典型案例，逐一分析了各方法的适用范围与局限性。关键结果显示，异戊二烯合酶周转率通常低于0.5/s，构成显著代谢瓶颈；DPPH比色法对月桂烯、γ-萜品烯和柠檬烯的最小检测浓度分别为10、15和200 μM；Tween 20筛选使α-红没药烯产量提高30%；适应性进化使类胡萝卜素产量提高3倍；工程化Erg20p使二萜类产量提高数百倍，而敲除多个负调控基因后红没药烯和香紫苏醇产量分别提升20倍和12倍。该综述揭示当前筛选手段多为间接检测，类胡萝卜素策略虽常用但存在假阳性和底物特异性限制，未来应优先开发生物传感器和嗅觉受体酵母等更直接、广谱、高通量的筛选平台，以突破异戊二烯类产物研发瓶颈。
创新点
对现有异戊二烯生物合成筛选技术进行了系统分类和批判性评价，指出了间接检测占主导的现状，并预测未来需开发更直接、广谱、高通量的筛选手段，特别是生物传感器和嗅觉受体酵母。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtB, crtI | 八氢番茄红素合酶, 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 红白筛选报告系统，用于检测GGPP合成酶活性 |
| Escherichia coli | 异戊二烯前体合成 | ispA | 牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 定向进化改变链长特异性，促进GGPP形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | Erg20p | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 工程化为GGPP合酶，解除二萜合成瓶颈 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | RBS突变提高甲羟戊酸产量3.5倍 |
| Bacillus subtilis | 异戊二烯代谢 | yhfR, nudF | YhfR, NudF | 催化 | 利用异戊二烯前体毒性筛选，鉴定异戊烯醇合成酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | — | β-胡萝卜素酮醇酶 | 催化 | 通过菌落颜色变化筛选高活性β-胡萝卜素酮醇酶 |
| Escherichia coli | 倍半萜合成 | BcBOT2 | 倍半萜合酶BcBOT2 | 催化 | 基于底物类似物释放甲醇的筛选，热稳定性提高12°C |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜合成 | AgBIS | 红没药烯合酶 | 催化 | 结合类胡萝卜素筛选和基因敲除，产量提高20倍 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | araC | AraC转录调控因子变体 | 调控 | 设计为响应甲羟戊酸的生物传感器，激活报告基因 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素合成途径 | — | — | 区室化 | 底盘细胞，经化学诱变和FCM筛选虾青素高产菌株 |
关键发现
- 异戊二烯合酶周转率通常低于0.5/s，是代谢瓶颈
- BcBOT2热稳定性提高12°C
- DPPH检测灵敏度为月桂烯10 μM、γ-萜品烯15 μM、柠檬烯200 μM
- Tween 20筛选获得产量提高30%的α-红没药烯突变株
- 适应性进化使类胡萝卜素产量提高3倍
- 工程化Erg20p使二萜类产量提高数百倍
- 敲除rox1、prb1、yjl064w、ypl062w使红没药烯产量提高20倍
- 六个基因缺失使香紫苏醇产量提高12倍
- FCM筛选获得虾青素产量提高3.8倍的突变株
- 甲羟戊酸生物传感器使甲羟戊酸产量提高7倍
- RBS变体使甲羟戊酸产量提高3.5倍
- TEAS突变体在65°C仍有活性，比野生型高约30°C。
研究结论
当前异戊二烯生产筛选策略虽多样但多为间接检测，类胡萝卜素筛选最常用但存在假阳性和适用性限制；未来应开发更直接、高通量、广谱的筛选方法，生物传感器和嗅觉受体酵母等是潜在方向。