Enhanced performance of the methylerythritol phosphate pathway by manipulation of redox reactions relevant to IspC, IspG, and IspH
- 作者
- Jia Zhou, Liyang Yang, Chonglong Wang, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Faculty of Life Science and Food Engineering, HuaiYin Institute of Technology; Division of Applied Life Science (BK21 Plus), PMBBRC, Gyeongsang National University; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2017.03.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中重组MEP途径异戊二烯类化合物产量低，IspC、IspG和IspH的氧化还原依赖反应及NADPH供应不足构成瓶颈
研究策略
通过操纵MEP途径外围代谢系统：过表达IDI平衡IPP/DMAPP比例，过表达Fpr-FldA氧化还原系统激活Fe-S蛋白，引入NADH激酶tPos5p增加NADPH供应并敲除yjgB减少NADPH消耗
核心内容
本研究以大肠杆菌DH5α为底盘，系统改造重组甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径以提高异戊二烯类化合物protoilludene的产量。通过构建完整重组MEP途径并逐级鉴定限速步骤，研究者发现关键瓶颈集中于IspC、IspG和IspH的氧化还原依赖反应及NADPH供应不足。据此采取三重策略：过表达IDI以平衡IPP/DMAPP比例，过表达Fpr-FldA电子传递系统以激活Fe-S蛋白IspG/IspH，并通过异源表达NADH激酶tPos5p增强NADPH再生、敲除yjgB减少NADPH消耗。结果显示，单独过表达IDI使产量从10.4 mg/L提升至67.4 mg/L；进一步引入Fpr-FldA后产量跃升至318.8 mg/L，较之前提高4.7倍；最终在yjgB敲除株中组合tPos5p，protoilludene产量达到512.7 mg/L，较初始菌株提高49倍。该工作证明操纵MEP途径外围氧化还原系统是突破途径自身瓶颈的有效手段，为大肠杆菌高效生产异戊二烯类化合物提供了明确的工程靶点。
创新点
['构建完整重组MEP途径并系统鉴定限速步骤，发现IDI过表达是关键', '证明过表达Fpr-FldA电子传递系统可显著增强IspG/IspH活性', '通过异源表达NADH激酶tPos5p和敲除NADPH消耗酶YjgB实现NADPH再生强化', '将protoilludene产量提升49倍，达到512.7 mg/L']
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | dxs | DXP合酶 | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，催化丙酮酸和G3P缩合为DXP |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispC | DXP还原异构酶 | 催化 | NADPH依赖的还原异构酶，催化DXP转化为MEP |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispD | CDPME合酶 | 催化 | 催化MEP与CTP缩合生成CDPME |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispE | CDPME激酶 | 催化 | 催化CDPME磷酸化生成CDPME2P |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispF | MEcPP合酶 | 催化 | 催化CDPME2P环化生成MEcPP |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispG | HMBPP合酶 | 催化 | Fe-S簇蛋白，催化MEcPP开环还原为HMBPP，需Fpr-FldA提供电子 |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | ispH | HMBPP还原酶 | 催化 | Fe-S簇蛋白，催化HMBPP还原生成IPP和DMAPP |
| Escherichia coli DH5α | IPP/DMAPP异构化 | idi | IPP异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP可逆异构化，平衡两者比例 |
| Escherichia coli DH5α | protoilludene合成途径 | ispA | FPP合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成法尼基焦磷酸(FPP) |
| Escherichia coli DH5α | protoilludene合成途径 | omp7 | protoilludene合酶 | 催化 | 来自Omphalotus olearius，催化FPP环化生成protoilludene |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径电子传递系统 | fldA | 黄素氧还蛋白I | 能量供给 | 电子载体，将电子从Fpr传递给IspG/IspH的Fe-S簇 |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径电子传递系统 | fpr | 铁氧还蛋白-NADP+还原酶 | 能量供给 | 催化NADPH氧化并将电子经FldA传递至IspG/IspH |
| Escherichia coli DH5α | NADPH再生 | maeB | NADP+依赖的苹果酸酶 | 能量供给 | 催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和NADPH，过表达反而抑制生长，需补充苹果酸 |
| Escherichia coli DH5α | NADPH再生 | udhA | 吡啶核苷酸转氢酶 | 能量供给 | 催化NADP+/NADH与NADPH/NAD+可逆互变，过表达对产量无显著影响 |
| Escherichia coli DH5α | NADPH再生 | tPos5p | NADH激酶 | 能量供给 | 来自酿酒酵母的截短NADH激酶，催化NADH磷酸化生成NADPH |
| Escherichia coli DH5α (yjgB敲除) | NADPH消耗 | yjgB | NADPH依赖的醛还原酶 | 催化 | 非必需的NADPH消耗酶，敲除该基因可减少NADPH浪费 |
关键发现
- ['仅含重组MEP途径质粒ME和protoilludene合成质粒AO时，protoilludene产量为10.4 mg/L（48 h）', '额外过表达IDI后产量提高至67.4 mg/L', '过表达Fpr-FldA复合物（ME-LP/AOI）使产量提高至318.8 mg/L，相比67.4 mg/L提高4.7倍
- 细胞OD600从10增至18', '引入NADH激酶tPos5p后产量达479.5 mg/L', '在yjgB敲除菌株中，ME-LP/AOItP组合产量达512.7 mg/L，较亲本菌株提高7.0%', '最终产量从10.4 mg/L提高到512.7 mg/L，提高49倍']
研究结论
IDI、Fpr-FldA氧化还原系统和NADPH再生是提升重组MEP途径通量的关键工程靶点，通过操纵外围代谢系统可突破途径自身瓶颈，显著提高异戊二烯类化合物产量