De novo production of prenylnaringenin compounds by a metabolically engineered Escherichia coli
- 作者
- Daniela Gomes, Joana L. Rodrigues, Nigel S. Scrutton, Ligia R. Rodrigues
- 单位
- CEB- Centre of Biological Engineering, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, Braga 4710-057, Portugal; LABBELS, Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal; Manchester Institute of Biotechnology, The University of Manchester, 131 Princess Street, Manchester M1 7DN, UK
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2025）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2025.05.017
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中实现异戊烯基柚皮素（PN）化合物的从头生物合成，需要克服两个关键瓶颈：细胞内DMAPP前体供应不足，以及植物来源膜结合型异戊烯基转移酶在大肠杆菌中表达困难。
研究策略
利用已优化的柚皮素高产菌株E. coli M-PAR-121作为底盘，系统测试11种异戊烯基转移酶（PTs）；通过CRISPR-Cas12a基因组整合增强DXS和IDI基因（单拷贝或双拷贝）提高DMAPP供应，并利用CRISPRi下调ispA基因以减少DMAPP竞争消耗；在96孔板、摇瓶和2L生物反应器中进行生产验证和培养基优化。
研究路线图
核心内容
该研究以代谢工程改造的大肠杆菌M-PAR-121为底盘，首次实现了异戊烯基柚皮素（PN）化合物的从头生物合成，无需外源添加柚皮素中间体。研究者系统测试了11种异戊烯基转移酶，并利用CRISPR-Cas12a基因组整合增强DXS和IDI基因表达以提升DMAPP前体供应，同时通过CRISPRi下调ispA基因减少DMAPP的竞争消耗，构建了10个DMAPP增强型菌株。经110种菌株/酶组合筛选，确定表达CloQ的最佳菌株在96孔板中可产生3'-PN 88.34 μM。摇瓶条件下采用TB培养基使3'-PN产量达160.57 μM，较LB+M9提高2.2倍。在2L生物反应器中通过两次葡萄糖补料，最终3'-PN产量达397.57 μM（135.33 mg/L），6-PN为25.61 μM，为迄今任何宿主中从头生产PN的最高报道值。研究还发现下调ispA的菌株均不产PN，表明DMAPP供应与途径平衡至关重要。该工作证明大肠杆菌可作为异戊烯基黄酮类化合物生产的有效底盘，为其他异戊烯基化合物的微生物合成提供了可行策略。
创新点
['首次报道以大肠杆菌为底盘从头生产异戊烯基柚皮素（PN）化合物，无需外源添加柚皮素中间体。', '应用CRISPR-Cas12a技术构建了10个DMAPP增强型大肠杆菌菌株，通过基因组整合DXS/IDI和CRISPRi下调ispA调控DMAPP代谢。', "通过筛选110种菌株/PT组合，确定E. coli M-PAR-121:EcDXS表达CloQ为最佳生产菌株，并在生物反应器中实现迄今最高水平的PN从头生产（3'-PN 397.57 μM，135.33 mg/L）。"]
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli M-PAR-121 | 柚皮素生物合成途径 | FJ TAL | 酪氨酸解氨酶 (TAL) | 催化 | 来自黄杆菌属，催化L-酪氨酸生成对香豆酸。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 柚皮素生物合成途径 | At4CL | 4-香豆酸:CoA连接酶 (4CL) | 催化 | 来自拟南芥，催化对香豆酸生成对香豆酰-CoA。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 柚皮素生物合成途径 | CmCHS | 查尔酮合酶 (CHS) | 催化 | 来自西葫芦，催化对香豆酰-CoA和丙二酰-CoA生成柚皮素查尔酮。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 柚皮素生物合成途径 | MsCHI | 查尔酮异构酶 (CHI) | 催化 | 来自苜蓿，催化查尔酮环化为柚皮素。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:EcDXS | MEP通路（DMAPP合成） | EcDXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | 将大肠杆菌内源DXS额外整合至lacZ位点，增强MEP途径通量。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:BsDXS | MEP通路（DMAPP合成） | BsDXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌的DXS，整合至基因组。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:ScIDI | MEP通路（DMAPP合成） | ScIDI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 来自酿酒酵母的IDI，催化IPP异构化为DMAPP。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:BIDI | MEP通路（DMAPP合成） | BIDI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 来自地衣芽孢杆菌的IDI。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:EcIDI | MEP通路（DMAPP合成） | EcIDI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IDI) | 催化 | 大肠杆菌内源IDI额外整合。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 (CRISPRi strains) | 类异戊二烯前体代谢 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 通过CRISPRi下调其表达（73%和46%）以减少DMAPP流向FPP的消耗，但产量未提高。 |
| Escherichia coli M-PAR-121:EcDXS | 异戊烯基转移反应 | cloQ | CloQ | 催化 | 来自玫瑰孢链霉菌的可溶性芳香族异戊烯基转移酶，最佳PT，催化柚皮素生成3'-PN和6-PN。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | nphB | NphB | 催化 | 来自链霉菌属的PT，测试中能产生少量PN。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | spPT | SpPT | 催化 | 来自链霉菌Act143的PT。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | ubiA | UbiA | 催化 | 来自大肠杆菌的PT，测试中能产生PN。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | anaPT | AnaPT | 催化 | 来自费希新萨托菌的PT，有密码子优化（coAnaPT）和非优化版本。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | cdpC3PT | CdpC3PT | 催化 | 来自费希新萨托菌的PT，非密码子优化。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | ecPT | EcPT | 催化 | 来自大肠杆菌的PT，测试中能产生3'-PN。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | hiPT | HIPT | 催化 | 来自蛇麻的植物PT，膜结合蛋白，在大肠杆菌中未能有效表达。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | SfN8DT-1 | SfN8DT-1 | 催化 | 来自苦参的植物PT，膜结合，未检测到表达和PN产生。 |
| Escherichia coli M-PAR-121 | 异戊烯基转移反应 | CsPT3 | CsPT3 | 催化 | 来自大麻的植物PT，膜结合，未有效表达。 |
关键发现
- 在96孔板筛选中，12种组合能够从葡萄糖从头产生PN，最佳菌株E. coli M-PAR-121:EcDXS（表达CloQ和柚皮素途径）产生3'-PN
- 34±15.22 μM和6-PN
- 20±1.20 μM。摇瓶实验中，使用TB培养基使3'-PN产量达160.57±23.60 μM，6-PN为4.40±1.85 μM，8-PN为2.70±0.15 μM，较LB+M9组合提高2.2倍。在2L生物反应器中，通过两次额外葡萄糖补料（10 g/L），最终3'-PN产量达397.57±8.25 μM（135.33 mg/L），6-PN为25.61±6.36 μM（8.72 mg/L），为迄今任何宿主中从头生产PN的最高报道值。此外，CRISPRi下调ispA 73%和46%的菌株均未产生PN，说明DMAPP供应与途径平衡至关重要。
研究结论
本研究证明大肠杆菌可作为从头生产异戊烯基柚皮素的有效底盘。通过增强MEP途径通量（DXS/IDI过表达）和筛选高活性可溶性PT（CloQ），成功实现了3'-PN、6-PN和8-PN的de novo合成，其中3'-PN产量显著高于已有酵母系统。该策略为其他异戊烯基黄酮类化合物的微生物生产提供了新思路，但PT酶效率和DMAPP供应仍需进一步优化以满足工业化需求。