Metabolic engineering of Escherichia coli for production of valerenadiene
- 作者
- S. Eric Nybo, Jacqueline Saunders, Sean P. McCormick
- 单位
- Ferris State University, College of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Sciences, Big Rapids, MI 49307, USA; Ferris State University, Department of Physical Sciences, Big Rapids, MI 49307, USA
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2017.10.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
缬草（Valeriana officinalis）根中缬草酸及其生合成中间体产量极低，限制了其结构活性关系研究和应用，需要开发经济高效的微生物生产平台。
研究策略
以大肠杆菌为底盘，表达来自缬草的缬草二烯合酶（VDS），通过密码子优化、工程化MEP途径、异源表达酿酒酵母MVA途径、优化启动子（P_LacO1、P_trc、P_T7）和培养基（甘油补充）等策略，逐步提高缬草二烯产量。
核心内容
该研究以大肠杆菌为底盘，通过系列代谢工程策略实现缬草二烯的高效微生物合成。首先对来自缬草的缬草二烯合酶基因进行密码子优化，使CAI从0.59提升至0.89，产量由野生型的12 μg/L提高至32 μg/L。随后共表达MEP途径关键酶DXS、IDI和FPS以增强FPP前体供应，使产量提升65倍至2.09 mg/L；添加3%甘油后再提高5.5倍至11.0 mg/L。比较不同启动子发现，以P_trc启动缬草二烯合酶并配合MEP途径时产量达20.3 mg/L。进一步引入异源酿酒酵母MVA途径，P_trc组合产量为42.5 mg/L，最终采用T7启动子（pET载体）与MVA途径组合获得最高产量62.0 mg/L，特定生产力19.4 mg/L/OD600。研究证明通过密码子优化、前体供应强化和强启动子组合可大幅提升植物源倍半萜在微生物中的合成效率，为缬草酸类活性天然产物的微生物制造奠定了基础。
创新点
['对缬草二烯合酶基因进行密码子优化，CAI从0.59提升至0.89，蛋白表达效率显著提高', '利用MEP途径关键酶（DXS、IDI、FPS）工程化改造，增强FPP前体供应', '引入异源酿酒酵母MVA途径，大幅提升FPP代谢流', '比较不同启动子（P_LacO1、P_trc、P_T7）对产量的影响，发现强启动子显著提高产量', '培养基中添加3%甘油使产量进一步提高']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5αZ1 | 倍半萜生物合成 | vds (wvds) | 缬草二烯合酶（野生型） | 催化 | 催化FPP环化生成缬草二烯，受P_LacO1启动子控制 |
| Escherichia coli DH5αZ1 / BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | cvds | 缬草二烯合酶（密码子优化型） | 催化 | 催化FPP环化生成缬草二烯，受P_LacO1、P_trc或P_T7启动子控制 |
| Escherichia coli DH5αZ1 | MEP途径 | dxs, idi, fps | DXS、IDI、FPS | 催化 | 过表达增强IPP/DMAPP和FPP前体供应 |
| Escherichia coli DH5αZ1 | MVA途径 | atoB, HMGS, HMGR, ERG12, ERG8, MVD1, IDI, ispA | 硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶 | 催化 | 异源酿酒酵母MVA途径，提供FPP前体 |
关键发现
- 野生型VDS（pZE-wvds）在LB培养基中48h产量为12 μg/L，密码子优化型（pZE-cvds）产量为32 μg/L，提高3倍
- 共表达MEP途径（dxs-idi-fps）使pZE-cvds产量提高65倍至2.09 mg/L
- 甘油补充使产量再提高5.5倍至11.0 mg/L
- P_trc启动子与MEP途径组合产量达20.3 mg/L
- 异源MVA途径与P_trc启动子组合产量为42.5 mg/L（6.07 mg/L/OD600）
- 最终使用P_T7启动子（pET-cvds）和MVA途径时，产量最高达62.0 mg/L，特定生产力19.4 mg/L/OD600。
研究结论
通过代谢工程成功构建了高效生产缬草二烯的大肠杆菌平台，最高产量62.0 mg/L，为缬草酸类似物的微生物合成奠定了基础。