Optimization of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid synthase production in Komagataella phaffii via post-translational bottleneck identification
- 作者
- Bastian Zirpel, Friederike Degenhardt, Chantale Zammarelli, Daniel Wibberg, Jörn Kalinowski, Felix Stehle, Oliver Kayser
- 单位
- Department of Technical Biochemistry, TU Dortmund University, Emil-Figge Str. 66, 44227 Dortmund, Germany; Center for Biotechnology (CeBiTec), Bielefeld University, Universitätsstr. 27, 33615, Bielefeld, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2018.03.008
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解决大麻萜酚酸合酶（THCAS）在Komagataella phaffii中异源表达时功能性蛋白产量低的问题，鉴定并克服翻译后折叠、辅因子供给等瓶颈。
研究策略
在THCAS高拷贝菌株中分别共表达12个来自K. phaffii的辅助蛋白基因（伴侣蛋白、折叠酶、辅因子合成酶、UPR调控因子等），通过筛选21个转化子统计评估各蛋白对THCAS活性的影响，再对有益蛋白进行组合优化，最终获得高产菌株并用于全细胞生物转化。
核心内容
该研究针对大麻萜酚酸合酶（THCAS）在Komagataella phaffii中异源表达时功能性蛋白产量低的问题，系统鉴定了翻译后瓶颈并加以克服。作者在THCAS高拷贝菌株中分别共表达12个来自K. phaffii的辅助蛋白基因，涵盖伴侣蛋白、折叠酶、辅因子合成酶及UPR调控因子等，每个转化子筛选21个克隆以保证统计可靠性。结果显示，共表达Hac1s可使THCAS体积活性平均提高4.1倍，组合表达Hac1s、CNE1和FAD1的最优菌株PP2CNE21Hac5_FAD1C7，其胞内THCAS活性较起始菌株提高了20倍。在15°C培养144小时后，胞内活性达62.4 nkat/gCDW，特异性活性和体积活性分别提高9.3倍和7.9倍。以该菌株进行全细胞生物转化，8小时内由10 mM CBGA产生3.05 g/L THCA，转化率达85.2%。研究表明，THCAS功能性表达受蛋白折叠、二硫键形成、FAD辅因子供给及UPR等多重翻译后瓶颈制约，组合共表达上述辅助蛋白可有效缓解这些限制，证明K. phaffii具备作为大麻素生产平台的潜力。
创新点
系统比较了12个辅助蛋白对THCAS功能表达的影响，发现Hac1s、CNE1、FAD1等组合可协同增效；通过筛选21个克隆保证统计可靠性；优化菌株在28°C筛选条件下实现20倍活性提升，并在全细胞转化中高效生产THCA。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) PP2_HC | 大麻素生物合成途径 | thcas | THCAS | 催化 | Δ9-四氢大麻酚酸合酶，催化CBGA氧化环化生成THCA；含有二硫键、N-糖基化位点及共价FAD辅因子 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 未折叠蛋白响应（UPR） | HAC1 | Hac1p | 调控 | UPR转录激活因子，剪接形式Hac1s；共表达使THCAS活性平均提高4.1倍 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 内质网蛋白质质量控制 | CNE1 | Cne1p | 调控 | 钙连蛋白样伴侣蛋白，参与糖蛋白正确折叠与质量控制 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 内质网蛋白质折叠 | KAR2 | Kar2p | 调控 | Hsp70分子伴侣，结合疏水肽段防止蛋白聚集 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 蛋白质折叠（二硫键形成） | PDI1 | Pdi1p | 催化 | 蛋白二硫键异构酶/折叠酶，催化二硫键正确排列 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | FAD辅因子合成 | FAD1 | Fad1p | 催化 | FAD合成酶，由FMN合成FAD，提高THCAS辅因子供给 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | FMN辅因子合成 | FMN1 | Fmn1p | 催化 | FMN合酶，由核黄素合成FMN；与FAD1共表达未显示额外增益 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 内质网蛋白质折叠 | LHS1 | Lhs1p | 调控 | Kar2p的核苷酸交换因子，共表达未显著提高THCAS活性 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | GDP-甘露糖合成与内质网质量控制 | SEC53 | Sec53p | 催化 | 磷酸甘露糖变位酶，参与GDP-甘露糖合成；共表达无显著效果 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 蛋白质折叠（脯氨酰异构） | CPR5 | Cpr5p | 催化 | 肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase），共表达无显著效果 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 氧化蛋白折叠 | ERO1 | Ero1p | 催化 | 内质网硫醇氧化酶，协助PDI1p再氧化；共表达无显著效果 |
| Komagataella phaffii (Pichia pastoris) | 氧化应激响应 | YAP1 | Yap1p | 调控 | 氧化应激转录因子，共表达未显著提高THCAS活性 |
关键发现
- 共表达12个辅助蛋白基因并各筛选21个克隆
- Hac1s共表达平均提高THCAS体积活性4.1倍
- 最优菌株PP2CNE21Hac5_FAD1C7（共表达Hac1s、CNE1、FAD1）的胞内体积THCAS活性比起始菌株PP2_HC提高20倍
- 在15°C培养144 h后，该菌株胞内活性达62.4 nkat/gCDW（507 pkat/mL），上清活性9.78 nkat/gCDW（79 pkat/mL），特异性活性提高9.3倍，体积活性提高7.9倍，胞内THCAS比例由63%升至86%
- 以OD600=100的细胞进行全细胞生物转化，8 h内由10 mM CBGA产生3.05 g/L THCA，相当于12.5% gTHCA/gCDW，CBGA转化率达85.2%
- 起始菌株PP2_HC的THCAS基因拷贝数为24±2
- 优化菌株THCAS活性较Taura等首次报道提高450倍以上。
研究结论
THCAS在K. phaffii中的功能性表达受到蛋白折叠、二硫键形成、FAD辅因子供给及UPR等多种翻译后瓶颈制约；共表达PDI1p、CNE1p、FAD1p、Kar2p和Hac1p可有效缓解这些瓶颈，其中Hac1s效果最强，但单拷贝已足够；组合表达Hac1s、CNE1和FAD1可使THCAS活性提高20倍，且该菌株能高效将CBGA转化为THCA，证明K. phaffii可作为大麻素生产平台。