Redox partner recognition and selectivity of cytochrome P450lin (CYP111A1)
- 作者
- Jessica A. Gable, Thomas L. Poulos, Alec H. Follmer
- 单位
- Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine; Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine; Department of Chemistry, University of California, Irvine
- 杂志
- Journal of Inorganic Biochemistry（2023）
- DOI
- 10.1016/j.jinorgbio.2023.112212
- 所属领域
- 生物化学
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解决的核心问题
解析细胞色素P450lin（CYP111A1）对氧化还原伴侣的选择性及其分子机制，特别是与P450cam严格选择性的差异。
研究策略
通过NADH消耗实验和停流动力学比较P450lin与非天然铁氧还蛋白Pdx和Arx及其突变体的活性；结合序列比对和AlphaFold结构预测分析蛋白间相互作用界面。
核心内容
本研究通过NADH消耗实验和停流动力学，系统比较了细胞色素P450lin（CYP111A1）与非天然铁氧还蛋白Pdx、Arx及其突变体的电子传递活性，并结合序列比对与AlphaFold结构预测解析其氧化还原伴侣选择性机制。结果显示，P450lin可利用非天然伴侣Arx高效转化芳樟醇，NADH消耗速率达179±17，而Pdx仅为5.44±0.45；Pdx双突变体D38L/Δ106将P450lin的NADH消耗速率提升至198±1，约为野生型Pdx的36倍，同时使氧复合物衰减速率增加约165倍。相比之下，P450cam仍严格依赖天然伴侣Pdx。序列分析显示Ldx与Arx同一性为54.90%，与Pdx为33.98%，但Pdx双突变体不诱导底物结合态的低自旋位移却能显著提高活性。研究表明，P450lin对氧化还原伴侣的选择性低于高度同源的P450cam，其结合界面相似但相对取向可能不同，伴侣结合导致氧复合物不稳定的机制或广泛保守于多种P450系统中。
创新点
发现P450lin对非天然氧化还原伴侣具有活性，并且Pdx双突变体D38L/Δ106可显著提高其活性，表明P450lin与伴侣的界面相似但相对方向可能不同；揭示氧化还原伴侣结合对氧复合物稳定性的普遍作用。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | linalool 8-羟基化 | CYP111A1 | Cytochrome P450lin (CYP111A1) | 催化 | 催化芳樟醇羟基化为8-羟基芳樟醇 |
| — | P450cam 电子传递链 | — | Putidaredoxin (Pdx) | 能量供给 | P450cam 的天然铁氧还蛋白，本文测试其与P450lin的交叉活性 |
| — | CYP101D1 电子传递链 | — | Arx | 能量供给 | CYP101D1 的天然铁氧还蛋白，与Ldx序列相似性高 |
| — | P450lin 电子传递链 | — | Ldx | 能量供给 | P450lin 的天然铁氧还蛋白，因表达困难未获得纯蛋白 |
| — | camphor 羟基化 | CYP101A1 | Cytochrome P450cam (CYP101A1) | 催化 | 作为对照，严格依赖天然伴侣Pdx |
| — | 电子传递链 | — | Pdx D38L/Δ106 | 能量供给 | Pdx双突变体，使P450lin活性最高，氧复合物衰变最快 |
关键发现
- ['P450lin 可利用非天然氧化还原伴侣 Arx 实现芳樟醇转化，NADH 消耗速率为 179±17 mM⁻¹ NADH μM⁻¹ P450 min⁻¹，而 Pdx 仅
- 44±0.45。', 'Pdx 双突变体 D38L/Δ106 使 P450lin 的 NADH 消耗速率提高到 198±1，约为 Pdx WT 的 36 倍，比 D38L 单突变体（40.3）高约 5 倍，比 Δ106（8.67）高约 20 倍。', 'Pdx D38L/Δ106 使 P450lin 氧复合物衰减速率增加约 165 倍（431.5 nm 处 k1=9.61±0.14 s⁻¹，对照
- 0584 s⁻¹）。', 'Ldx 与 Arx 序列同一性为
- 90%，与 Pdx 为
- 98%。', 'Pdx D38L/Δ106 不诱导芳樟醇结合态 P450lin 的低自旋位移，但仍能显著提高活性。', 'P450cam 仍严格依赖 Pdx，非天然伴侣无活性。']
研究结论
P450lin 对氧化还原伴侣的选择性低于 P450cam，尽管两者系统高度同源；其结合界面与 P450cam-Pdx 相似但相对取向可能不同。伴侣结合导致氧复合物不稳定，该机制可能在多种 P450 中保守。