Development of a luciferase reporter Jurkat cell line under the control of endogenous interleukin-2 promoter
- 作者
- Jinqi Liu, Ren Liu, Peter Gray, Zhenyi Liu, Xiaoxia Cui, Guanghua Li, Zhong Liu
- 单位
- Merck & Co., Inc., 2000 Galloping Hill Rd, Kenilworth, NJ 07033, USA; Horizon Discovery, 2033 Westport Center Drive, Saint Louis, MO 63146, USA
- 杂志
- Journal of Immunological Methods（2017）
- DOI
- 10.1016/j.jim.2017.08.006
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
传统报告基因细胞系采用随机整合和人工启动子，不能真实反映生理信号，需要构建更接近内源调控的报告细胞系
研究策略
利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组将萤火虫荧光素酶基因替换内源IL2基因的一个等位基因，使报告基因受内源IL2启动子调控，同时保留另一个等位基因以维持IL-2分泌功能
核心内容
本研究利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组将萤火虫荧光素酶基因精确替换Jurkat细胞中内源IL2基因的一个等位基因，使报告基因受内源IL2启动子的天然染色质环境调控，同时保留另一等位基因维持IL-2分泌功能，成功构建了1F2报告细胞系。在PMA（200 ng/ml）联合离子霉素刺激下，荧光素酶活性呈浓度依赖性增加；在抗CD3（2 μg/ml）联合抗CD28刺激下亦呈剂量依赖性反应。1F2细胞IL-2分泌量约为亲本Jurkat细胞的一半。进一步构建表达人GITR的1F2-hGITR细胞，发现抗GITR抗体（0.1-10 μg/ml）与亚适浓度抗CD3（0.8 μg/ml）联合可剂量依赖性增强荧光素酶活性和IL-2分泌，并与CD28共刺激产生协同效应。该工作首次实现了报告基因在内源启动子控制下的精确整合，所构建的细胞系更真实反映生理信号，为免疫调节剂活性评估及构建其他报告细胞系提供了新策略。
创新点
首次报道将报告基因精确插入内源基因启动子下构建报告细胞系，保留天然染色质环境；并成功用于评估GITR共刺激激动剂抗体
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Jurkat | T细胞受体(TCR)信号通路 | IL2 | IL-2 | 调控 | 内源IL2基因的一个等位基因被萤火虫荧光素酶替换，另一个等位基因保留，IL-2分泌通路完整 |
| Jurkat | CRISPR/Cas9基因编辑 | Cas9 | Cas9 | 催化 | 用于在内源IL2位点产生双链断裂并介导同源重组插入荧光素酶基因 |
| Jurkat | 报告基因检测 | luciferase | 萤火虫荧光素酶 | 催化 | 受内源IL2启动子调控，通过化学发光定量报告IL2转录活性 |
| Jurkat | GITR共刺激通路 | TNFRSF18 | 人GITR | 调控 | 通过慢病毒转导在1F2细胞中表达，用于评估GITR激动剂抗体的共刺激活性 |
关键发现
- 成功构建1F2细胞系，荧光素酶活性在PMA（200 ng/ml）联合离子霉素刺激下呈浓度依赖性增加
- 在抗CD3（2 μg/ml）联合抗CD28刺激下也呈剂量依赖性增加
- 1F2细胞IL-2分泌量约为亲本Jurkat细胞的一半
- 在表达人GITR的1F2-hGITR细胞中，抗GITR抗体（0.1-10 μg/ml）与亚适浓度抗CD3（0.8 μg/ml）联合可剂量依赖性增加荧光素酶活性和IL-2分泌，且与CD28共刺激有协同作用
- 采用MOI 0.04慢病毒转导实现约单拷贝GITR表达
研究结论
通过CRISPR/Cas9将报告基因置于内源IL2启动子下，成功构建了更生理相关的Jurkat报告细胞系，可用于免疫调节剂（如GITR激动剂）的活性评估，该方法为构建其他报告细胞系提供了新策略