Molecular cloning, expression profiling and functional analysis of a DXR gene encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase from Camptotheca acuminata

作者: Hongyan Yao, Yifu Gong, Kaijing Zuo, Hua Ling, Chengxiang Qiu, Fei Zhang, Yechun Wang, Yan Pi, Xiang Liu, Xiaofen Sun, Kexuan Tang
单位: Plant Biotechnology Research Center, Shanghai Key Laboratory of Agrobiotechnology, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, School of Agriculture and Biology, School of Life Science and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, People's Republic of China; State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, Morgan-Tan International Center for Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, People's Republic of China; Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, People's Republic of China
杂志: Journal of Plant Physiology（2006）
DOI: 10.1016/j.jplph.2006.12.001
所属领域: 代谢工程
关键词: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomeraseCamptotheca acuminataCamptothecin biosynthesisMethyl jasmonateRapid amplification of cDNA ends
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解决的核心问题

克隆并解析喜树（Camptotheca acuminata）中1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）基因在喜树碱生物合成途径中的作用。

研究策略

利用RACE技术克隆CaDXR全长cDNA；通过序列比对、系统发育分析和三维结构建模进行生物信息学分析；用半定量RT-PCR分析组织表达模式和MeJA诱导表达；通过大肠杆菌颜色互补实验验证其功能。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究首次从珙桐科植物喜树中克隆了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因CaDXR。通过RACE技术获得全长cDNA共1823 bp，其中开放阅读框1416 bp，编码472个氨基酸，预测分子量51.4 kDa，等电点7.18。序列分析显示CaDXR与银杏DXR的氨基酸一致性达85%，并含有质体转运肽、富含脯氨酸区域和NADPH结合基序等典型功能结构域。组织表达分析表明CaDXR在茎中强表达，叶和根中弱表达；经100 mM MeJA处理后，其表达在24小时达到峰值，72小时仍高于对照水平，证实其为MeJA响应基因。在大肠杆菌功能互补实验中，共转化pTrc-CaDXR与类胡萝卜素合成质粒pAC-BETA的菌株比对照积累更多类胡萝卜素，而单独转化pAC-BETA的对照无明显积累，证明CaDXR编码具有功能的DXR蛋白。该结果说明CaDXR是MEP途径的关键酶，参与喜树碱前体供应，可能作为代谢工程中调控喜树碱产量的重要靶点。

创新点

首次从珙桐科（Nyssaceae）植物喜树中克隆DXR基因；证实CaDXR是MeJA响应基因；功能互补实验证明CaDXR可促进类胡萝卜素积累。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
大肠杆菌 DH5α	甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径/类胡萝卜素生物合成	CaDXR	1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）	催化	功能互补实验中将CaDXR与类胡萝卜素基因簇共转化，促进类胡萝卜素积累
喜树（Camptotheca acuminata）	喜树碱生物合成途径（MEP途径）	CaDXR	DXR	催化	在茎中强表达，受MeJA诱导

关键发现

成功克隆了喜树DXR基因CaDXR，其全长cDNA为1823 bp，包含1416 bp开放阅读框，编码472个氨基酸，预测分子量51.4 kDa，等电点7.18。CaDXR与银杏DXR氨基酸序列一致性为85%，与其他植物DXR一致性为80%-84%。CaDXR含有质体转运肽、富含脯氨酸区域和NADPH结合基序。组织表达分析显示CaDXR在茎中强表达，叶和根中弱表达。用100 mM MeJA处理后，CaDXR表达在24 h达到最高，随后逐渐下降，但72 h时仍高于对照。大肠杆菌功能互补实验表明，共转化pTrc-CaDXR和pAC-BETA的DH5α菌株比对照积累更多的类胡萝卜素，而单独转化pAC-BETA或空载体pTrc的对照不能增加类胡萝卜素积累。

研究结论

CaDXR编码一个有功能的DXR蛋白，是MEP途径的关键酶，参与喜树碱生物合成；CaDXR可被MeJA诱导表达，可能是调控喜树碱产量的重要靶点。