The subcellular localization of periwinkle farnesyl diphosphate synthase provides insight into the role of peroxisome in isoprenoid biosynthesis
- 作者
- Insaf Thabet, Grégory Guirimand, Vincent Courdavault, Nicolas Papon, Stéphanie Godet, Christelle Dutilleul, Sadok Bouzid, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Marc Clastre, Andrew J. Simkin
- 单位
- Université François-Rabelais de Tours, EA2106, Biomolécules et Biotechnologies Végétales, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France; Laboratoire de Biotechnologie et Physiologie Végétale, Faculté des Sciences de Tunis, Département des Sciences Biologiques, 2092 El-Manar II, Tunis, Tunisia
- 杂志
- Journal of Plant Physiology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.jplph.2011.06.017
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中短链法尼基焦磷酸合酶（FPS）异构体的亚细胞定位长期不明确，传统认为其存在于细胞质中，但近期研究发现甲羟戊酸（MVA）途径部分酶定位于过氧化物酶体，因此需要明确长春花（Catharanthus roseus）短链FPS的实际亚细胞定位及其在异戊二烯生物合成中的潜在作用。
研究策略
从长春花中克隆FPS cDNA（CrFPS），通过酵母功能互补实验验证其酶活性，并利用YFP融合蛋白（CrFPS-YFP和YFP-CrFPS）在长春花悬浮细胞中进行瞬时表达，借助荧光显微镜与过氧化物酶体和细胞质标记共定位分析亚细胞分布。
核心内容
本研究从长春花中克隆了法尼基焦磷酸合酶基因CrFPS，通过酵母功能互补实验证实其具有FPS酶活性，能够恢复erg20Δ突变株在诱导培养基上的生长。利用YFP融合蛋白在长春花悬浮细胞中进行瞬时表达和共定位分析，发现YFP-CrFPS呈点状荧光并与过氧化物酶体标记共定位，而CrFPS-YFP呈细胞质弥散分布，首次实验证明植物短链FPS异构体靶向过氧化物酶体。CrFPS开放阅读框为1038 bp，编码345个氨基酸，预测分子量39.9 kDa，与拟南芥AtFPS1/AtFPS2的一致性约80%，与酵母FPS一致性为49%。结合MVA途径中PMK和MVD等酶的过氧化物酶体定位，该结果改变了传统认为FPS仅存在于细胞质的认知，提示植物细胞中可能存在过氧化物酶体、线粒体和细胞质多个相对独立的FPP池，分别供应不同异戊二烯末端产物的合成。这一发现为解析植物异戊二烯代谢的亚细胞区室化调控提供了新视角，对代谢工程中精准调控萜类合成具有重要参考价值。
创新点
首次通过实验直接证明植物短链FPS异构体靶向过氧化物酶体；发现CrFPS的C端区域可能包含非经典过氧化物酶体靶向信号；结合MVA途径其他酶（如PMK、MVD）的过氧化物酶体定位，提出植物异戊二烯代谢中过氧化物酶体的新作用。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (长春花) 悬浮细胞系C20D | 甲羟戊酸（MVA）途径 / 异戊二烯生物合成 | CrFPS (GenBank: HQ316638) | 法尼基焦磷酸合酶 (Farnesyl diphosphate synthase, FPS) | 催化 | 催化IPP和DMAPP经两次缩合生成FPP；定位过氧化物酶体，与YFP融合定位取决于融合方向 |
| Saccharomyces cerevisiae 菌株YJL167W (erg20Δ/ERG20) | 甾醇生物合成（FPP必需） | ERG20 (内源FPS基因，被CrFPS互补) | 酵母法尼基焦磷酸合酶 (Erg20p) | 催化 | 用于CrFPS功能互补实验，验证CrFPS具有FPS活性 |
| Catharanthus roseus 细胞 | 异戊二烯生物合成 | YFP-CrFPS 融合基因 | YFP-CrFPS融合蛋白 | 催化 | YFP位于N端时定位于过氧化物酶体；CrFPS-YFP（YFP在C端）则定位于细胞质，提示CrFPS的C端区域可能参与过氧化物酶体靶向 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 参考序列 | 异戊二烯生物合成 | AtFPS1 (At5g47770) 和 AtFPS2 (At4g17190) | AtFPS1S/AtFPS1L/AtFPS2 | 催化 | 长型AtFPS1L定位于线粒体，短型AtFPS2与CrFPS相似，但此前无定位报道 |
关键发现
- CrFPS cDNA全长1238 bp，开放阅读框为1038 bp，编码345个氨基酸，预测分子量为39.9 kDa
- CrFPS与其他植物FPS的氨基酸序列一致性约80%，与酵母FPS的一致性为49%，与人和大鼠FPS的一致性为44%
- 酵母功能互补实验表明CrFPS能恢复erg20Δ（FPS缺失）突变株在诱导培养基（YPG）上的生长，但无法在非诱导培养基（YPD）上生长，且无法在含有FOA的培养基上失去质粒，证实CrFPS具有法尼基焦磷酸合酶活性
- 亚细胞定位实验显示YFP-CrFPS融合蛋白呈点状荧光并与过氧化物酶体标记共定位，而CrFPS-YFP融合蛋白呈细胞质弥散分布，表明CrFPS定位于过氧化物酶体（部分蛋白可能保留在细胞质中）。
研究结论
长春花短链FPS（CrFPS）靶向过氧化物酶体，而非传统认为的细胞质；植物中可能存在过氧化物酶体、线粒体和细胞质多个FPP半独立池，分别供应不同异戊二烯末端产物的合成，过氧化物酶体在异戊二烯生物合成中具有重要角色。