Overexpression of tomato SIGGP-LIKE gene improves tobacco tolerance to methylviologen-mediated oxidative stress
- 作者
- Dong-Yue Yang, Na-Na Ma, Kun-Yang Zhuang, Shao-Bo Zhu, Zhong-Ming Liu, Xing-Hong Yang
- 单位
- 山东农业大学生命科学学院，作物生物学国家重点实验室，泰安，山东 271018，中国
- 杂志
- Journal of Plant Physiology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.jplph.2016.10.013
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究番茄SIGGP-LIKE基因在甲基紫精介导的氧化胁迫下的功能，探索通过调控抗坏血酸合成来提高植物氧化胁迫耐受性的策略。
研究策略
克隆番茄SIGGP-LIKE基因，构建35S启动子驱动的过表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，获得过表达株系；比较野生型和转基因烟草在MV处理下的抗坏血酸含量、APX活性、ROS水平、膜损伤程度、光合参数、紫黄质循环脱环氧化状态及D1蛋白含量，揭示其耐受机制。
核心内容
本研究从番茄中克隆了一个与已知 SIGGP 序列同源性仅 59% 的新基因 SIGGP-LIKE，其编码定位于细胞核的 GDP-L-半乳糖磷酸化酶。通过农杆菌介导法在烟草中过表达该基因，并比较野生型与转基因株系在甲基紫精（MV）胁迫下的生理差异。结果显示，过表达株系的还原型抗坏血酸含量较野生型提高 1.51 至 2.13 倍，MV 处理后 AsA/DHA 比值也显著升高，同时抗坏血酸过氧化物酶活性最高达 67.11 μmol g⁻¹ FW min⁻¹，而野生型仅为 29.19。转基因植株中 H₂O₂ 和超氧阴离子积累显著降低，丙二醛含量和相对电导率的增幅也较小，表明膜损伤减轻；净光合速率和 Fv/Fm 的下降幅度均小于野生型，且紫黄质循环脱环氧化状态（Z/(V+A+Z)）在未处理时即高出约 5 倍。该研究首次揭示 SIGGP-LIKE 通过提升抗坏血酸合成、增强活性氧清除能力并维持 PSII 功能来提高植物抗氧化胁迫耐受性，为抗坏血酸途径的代谢工程改良提供了新靶点。
创新点
1）克隆并鉴定了番茄中与已知SIGGP序列同源性仅为59%的新基因SIGGP-LIKE，发现其编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶并定位于细胞核；2）首次报道过表达SIGGP-LIKE通过提高还原型AsA含量和AsA/DHA比值，增强APX活性，降低ROS积累，促进紫黄质循环脱环氧化，从而减轻MV胁迫下的PSII光抑制，提高植物抗氧化胁迫能力。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. NC89） | 抗坏血酸生物合成（Smirnoff-Wheeler途径） | SIGGP-LIKE | SIGGP-LIKE（GDP-L-半乳糖磷酸化酶） | 催化 | 外源过表达，提高还原型AsA含量 |
| 本氏烟（Nicotiana benthamiana） | 亚细胞定位 | SIGGP-LIKE（与GFP融合） | SIGGP-LIKE-GFP融合蛋白 | 区室化 | 瞬时表达证明SIGGP-LIKE定位于细胞核 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 抗坏血酸-过氧化物酶循环（ROS清除） | — | APX（抗坏血酸过氧化物酶） | 催化 | MV胁迫下转基因株系APX活性显著高于WT |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 紫黄质循环 | — | VDE（紫黄质脱环氧化酶） | 催化 | AsA作为辅因子，转基因株系脱环氧化状态更高 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 光合作用（PSII） | psbA（内源） | D1蛋白 | 能量供给 | MV处理12 h后转基因株系D1蛋白降解较少 |
关键发现
- 过表达SIGGP-LIKE显著提高转基因烟草还原型AsA含量：OE-1、OE-3、OE-6分别比WT提高1.51、2.13、2.02倍
- MV处理后AsA/DHA比值分别提高1.84、2.31、1.99倍。转基因株系H2O2和O2·-积累量显著低于WT：H2O2在WT中增加2.22倍，而在OE-1、OE-3、OE-6中仅增加1.52、1.32、1.61倍
- O2·-分别增加3倍（WT）与2.71、2.42、1.97倍（转基因株系）。MDA含量在WT中升高约6倍，转基因株系升高3~4倍
- 相对电导率WT升至70%，转基因株系为53%~61%。MV处理24 h后，OE-1、OE-3、OE-6的APX活性分别为54.69、67.11、55.89 μmol g^-1 FW min^-1，WT仅29.19 μmol g^-1 FW min^-1。Pn下降幅度分别为69.34%、39.39%、69.28%（WT为85%），Fv/Fm下降幅度类似（WT为95%）。此外，转基因株系紫黄质循环中Z/(V+A+Z)比值未处理时比WT高约5倍。种子萌发率在5和10 μmol/L MV下WT从25%降至14%，转基因株系受影响很小。
研究结论
番茄SIGGP-LIKE基因编码定位在细胞核的GDP-L-半乳糖磷酸化酶，过表达该基因可增强烟草抗氧化胁迫能力，其机制是通过提高抗坏血酸合成水平维持较高的APX活性，从而及时清除过量ROS，减少膜损伤，并维持PSII的D1蛋白含量和光合功能，减轻光抑制。