Embryogenic callus induction from immature zygotic embryos and genetic transformation of Larix kaempferi 3x Larix gmelinii 9

作者: Sufang Zhang, Shanshan Yan, Peiqi An, Qing Cao, Chen Wang, Junhui Wang, Hanguo Zhang, Lei Zhang
单位: State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin, China; State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Chinese Academy of Forestry), Beijing, China
杂志: PLoS ONE（2021）
DOI: 10.1371/journal.pone.0258654
所属领域: 植物生物技术
关键词: 体细胞胚胎发生农杆菌介导转化杂种落叶松胚性愈伤组织遗传转化
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解决的核心问题

落叶松遗传转化效率低，缺乏高效的胚性愈伤诱导和遗传转化体系

研究策略

以未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织，优化植物生长调节剂和培养条件，并通过农杆菌介导法转化胚性愈伤组织

研究路线图

100%

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核心内容

本研究以杂种落叶松（日本落叶松×兴安落叶松）未成熟合子胚为外植体，系统优化了胚性愈伤诱导、增殖、体细胞胚成熟及农杆菌介导遗传转化各环节条件。通过3% NaClO灭菌10分钟获得90%外植体存活率；7月1日前子叶期取材时胚性愈伤诱导率最高达10.83%；在含0.5 mg/L 2,4-D和0.2 mg/L KT的1/2-BM培养基上培养12天增殖率可达323.08%。体细胞胚成熟阶段，45 mg/L ABA与75 g/L PEG4000组合使体细胞胚数量达到210个/g鲜重，萌发率为84%。遗传转化采用农杆菌侵染液OD600=0.5、共培养2天及4 mg/L潮霉素筛选，抗性愈伤转化率达32.1%，较已有报道提高16~32倍。该研究建立了落叶松从胚性愈伤诱导到遗传转化的完整高效体系，为落叶松遗传改良及优良种质快速繁殖提供了可行技术路径。

创新点

建立了杂种落叶松（日本落叶松×兴安落叶松）的高效体细胞胚胎发生和农杆菌介导遗传转化体系，转化率达32.1%，较已有报道提高16~32倍

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
杂种落叶松（Larix kaempferi × Larix gmelinii）胚性愈伤组织	体细胞胚胎发生	hpt	潮霉素磷酸转移酶	催化	筛选标记基因，催化潮霉素失活
杂种落叶松（Larix kaempferi × Larix gmelinii）胚性愈伤组织	体细胞胚胎发生	uidA (GUS)	β-葡萄糖醛酸酶	催化	报告基因，用于GUS染色验证转化

关键发现

最佳灭菌条件为3% NaClO处理10分钟，存活率90%
最佳取材时间为7月1日（前子叶期），胚性愈伤诱导率最高10.83%
最佳增殖培养基为1/2-BM（0.5 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L KT），培养12天增殖最快，增殖率达323.08%
最佳预培养培养基为1/4 BM + 10 g/L肌醇 + 60 g/L蔗糖，体细胞胚数量达140个/g鲜重
ABA 45 mg/L与PEG4000 75 g/L组合时体细胞胚数量最大，为210个/g鲜重，萌发率84%
最佳遗传转化条件为侵染液OD600=0.5、共培养2天、潮霉素筛选浓度4 mg/L，抗性愈伤转化率32.1%。

研究结论

本研究建立了杂种落叶松胚性愈伤组织诱导、增殖、体细胞胚成熟和遗传转化体系，为落叶松遗传改良和优异种质快繁提供了基础。