Thermostable carbohydrate binding module increases the thermostability and substrate-binding capacity of Trichoderma reesei xylanase 2
- 作者
- He Jun, Yu Bing, Zhang Keying, Ding Xuemei, Chen Daiwen
- 单位
- Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Yaan, Sichuan 625014, PR China; Key Laboratory of Animal Disease-Resistance Nutrition, Ministry of Education, PR China
- 杂志
- New Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.nbt.2009.04.002
- 所属领域
- 蛋白质工程
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解决的核心问题
提高里氏木霉木聚糖酶Xyn2的热稳定性，使其适应高温工业条件。
研究策略
将Thermotoga maritima XynA的N端热稳定结构域A2融合到Xyn2的N端，并在毕赤酵母X-33中实现分泌表达，随后比较融合酶与天然Xyn2的生化性质。
研究路线图
核心内容
为提升里氏木霉木聚糖酶Xyn2在高温工业条件下的适用性，该研究将海桐热袍菌XynA的N端热稳定结构域A2融合至Xyn2的N端，并在毕赤酵母X-33中实现分泌表达，系统比较了融合酶与天然Xyn2的酶学性质。结果显示，融合酶的最适温度达65°C，较天然酶提高10°C；在60°C孵育30分钟后仍保留85%以上活性，而天然酶仅保留44%；70°C处理30分钟后融合酶活性保留41%，天然酶仅剩5.6%。融合酶最适pH为6.0，对木聚糖的底物结合能力显著增强，水解产物以木二糖和木三糖为主，表明其仍为内切木聚糖酶。重组Xyn2分子量约21 kDa，融合酶约26 kDa。该工作证实A2结构域兼具热稳定与底物结合双重功能，其融合策略有效同步提升了酶的热稳定性和底物亲和力，为工业高温条件下的木聚糖降解提供了具有应用潜力的候选酶。
创新点
将A2结构域融合到Xyn2的N端，同时提高了酶的热稳定性和底物结合能力，并证实A2结构域兼具热稳定和底物结合功能。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 木聚糖降解 | xyn2 | Xyn2 | 催化 | 重组表达的天然木聚糖酶，分子量21 kDa |
| Pichia pastoris X-33 | 木聚糖降解 | 融合基因A2-xyn2 | Xyn2-A2融合酶 | 催化 | 融合T. maritima的A2结构域，分子量26 kDa，最适温度65℃ |
| — | 木聚糖降解 | xynA（A2编码区） | A2结构域 | 调控 | 来自XynA的N端结构域，增强热稳定性和底物结合能力 |
关键发现
- 融合酶最适温度为65°C，比天然Xyn2高10°C
- 在60°C孵育30分钟后保留85%以上活性（Xyn2仅保留44%）
- 在65°C孵育30分钟后仍保留61%活性
- 在70°C孵育30分钟后保留41%活性（Xyn2仅5.6%）。最适pH为6.0。融合酶对木聚糖的底物结合能力明显增强。水解产物以木二糖和木三糖为主，表明为内切木聚糖酶。重组Xyn2分子量为21 kDa，融合酶为26 kDa。
研究结论
本研究将A2结构域融合到Xyn2 N端，显著提高了酶的热稳定性和底物结合能力，融合酶在工业高温应用中具有潜力。