Promoting artemisinin biosynthesis in Artemisia annua plants by substrate channeling
- 作者
- Junli Han, Hongzhen Wang, Selvaraju Kanagarajan, Mengshu Hao, Anneli Lundgren, Peter E. Brodelius
- 单位
- Department of Chemistry and Biomedical Sciences, Linnaeus University; Zhejiang Agriculture and Forestry University; Department of Plant Breeding, Swedish University of Agricultural Sciences; Department of Biology, Lund University
- 杂志
- MOLECULAR PLANT（2016）
- DOI
- 10.1016/j.molp.2016.03.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素生物合成途径中的关键酶ADS（紫穗槐二烯合酶）催化效率极低，是限速步骤，导致青蒿素产量不足，难以满足疟疾治疗需求。
研究策略
采用底物通道策略，将FDS（法尼基焦磷酸合酶）与ADS融合表达，使FDP直接传递给ADS，避免与细胞质中的底物库平衡，提高局部底物浓度，从而加速青蒿素前体紫穗槐二烯的合成。使用组成型CaMV35S启动子和毛状体特异CYP71AV1启动子在两个高青蒿素产量品种（重庆和Anamed）中表达融合基因。
核心内容
针对青蒿素合成途径中紫穗槐二烯合酶（ADS）催化效率低这一限速瓶颈，本研究在青蒿中引入底物通道策略，将法尼基焦磷酸合酶（FDS）与ADS融合为双功能酶，使FDP可被直接传递给ADS，以提高其局部底物浓度。融合基因分别在组成型CaMV35S启动子和毛状体特异CYP71AV1启动子控制下，于重庆和Anamed两个高产青蒿品种中表达。结果显示，在CYP71AV1启动子驱动下，两个品种的青蒿素含量分别提高至野生型的2.5倍和2.0倍，绝对含量均约为2.5%干重；而CaMV35S启动子虽使ADS转录水平最高提升24倍，但青蒿素含量增幅反而更小。双氢青蒿酸和青蒿素显著增加，青蒿酸仅微增。该结果表明，融合酶通过底物通道效应使ADS接近底物饱和，显著提升青蒿素产量，且毛状体特异表达因更贴合青蒿素合成的空间定位而优于组成型表达，为植物天然产物代谢工程提供了有效策略。
创新点
首次在青蒿中应用底物通道策略，通过融合FDS-ADS酶提高青蒿素产量；比较了组成型启动子与毛状体特异启动子的效果，证明毛状体特异表达更有利于青蒿素生物合成。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua L. var. Chongqing | 青蒿素生物合成途径 | ADS-FDS (fused) | ADS-FDS融合蛋白 | 催化 | 融合蛋白包含紫穗槐二烯合酶(ADS)和法尼基焦磷酸合酶(FDS)，用于底物通道 |
| Artemisia annua L. var. Anamed | 青蒿素生物合成途径 | ADS-FDS (fused) | ADS-FDS融合蛋白 | 催化 | 融合蛋白在另一个高产品种中表达 |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | amorphadiene 12-hydroxylase (CYP71AV1) | 催化 | 其启动子用于毛状体特异表达融合基因 |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | ADS (amorpha-4,11-diene synthase) | ADS | 催化 | 限速酶，催化FDP转化为紫穗槐二烯 |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | FDS (farnesyl diphosphate synthase) | FDS | 催化 | 催化IDP和DMADP生成FDP |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | DBR2 | artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase | 催化 | 位于分支点的关键酶，将流量导向双氢青蒿酸和青蒿素 |
关键发现
- 在转基因青蒿中，融合基因[ADS-FDS]在CYP71AV1启动子控制下，重庆品种中青蒿素含量提高至野生型的2.5倍，Anamed品种提高2.0倍，绝对含量均约为2.5%干重（DW）
- 而CaMV35S启动子虽使ADS转录水平提高更多（重庆品种中最高达24倍，Anamed中6.5倍），但青蒿素含量提升不如CYP71AV1启动子
- 同时，FDS转录水平在转基因植株中升高不显著，野生型FDS C值约20，融合基因C值约28（CYP71AV1启动子）和24（CaMV35S启动子）
- 双氢青蒿酸和青蒿素含量显著增加，而青蒿酸和青蒿素B仅微增。
研究结论
通过将FDS与ADS融合形成双功能酶，利用底物通道效应提高ADS周围局部FDP浓度，使ADS接近底物饱和，可显著提高青蒿素产量；毛状体特异启动子驱动的融合基因表达效果优于组成型启动子，因为青蒿素生物合成途径位于腺毛状体中，组成型表达导致融合酶分布至非靶标组织。