In silico analysis enabling informed design for genome editing in medicinal cannabis; gene families and variant characterisation
- 作者
- L. Matchett-Oates, S. Braich, G. C. Spangenberg, S. Rochfort, N. O. I. Cogan
- 单位
- Agriculture Victoria, AgriBio, The Centre for AgriBioscience, Bundoora, Victoria, Australia; School of Applied Systems Biology, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia
- 杂志
- PLoS ONE（2021）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0257413
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
大麻中尚未成功报道编辑大麻素生物合成基因，且由于基因家族高同源性和大量SNP导致CRISPR、ZFN、TALEN等基因组编辑技术设计困难，缺乏系统性、可跨基因型的编辑靶点设计方案。
研究策略
利用已发表的大麻泛基因组和Cannbio-2参考基因组，通过BLAST挖掘所有大麻素生物合成相关基因并确定拷贝数；对660个品种进行重测序鉴定SNP；综合CHOPCHOP、CRISPR MultiTargeter、Crispor和ZiFit等在线工具设计sgRNA，并用Sequencher人工比对避免SNP与脱靶，从而设计通用型或基因特异性sgRNA。
核心内容
该研究针对药用大麻中因基因家族高同源性和大量单核苷酸多态性（SNP）导致基因组编辑难以设计的问题，提出了一个系统性、可跨基因型的生物信息学设计框架。研究基于已发表的大麻泛基因组和Cannbio-2参考基因组，通过BLAST挖掘全部大麻素生物合成相关基因并确定拷贝数，对660个品种进行重测序鉴定SNP，综合多种在线工具设计sgRNA，并辅以人工比对排除SNP干扰和脱靶风险。结果显示，CBDAS基因存在9个拷贝或同源物（含2个功能拷贝），THCAS仅1个拷贝，而FAD2有4个拷贝；各基因在泛基因组中SNP数量从200余个到264个不等。最终设计出145条经BLAST确认无20nt完全匹配脱靶位点的通用型sgRNA。该框架不仅首次为大麻全大麻素生物合成途径建立了基于泛基因组信息的编辑设计最佳实践流程，也可推广至其他多倍体或高同源序列物种，为精准编辑和大麻品种改良提供了重要工具基础。
创新点
首次为大麻全大麻素生物合成途径建立基于泛基因组信息的sgRNA设计最佳实践流程；系统评估了基因拷贝数变异和SNP对编辑设计的影响；设计了145条可跨基因型使用的通用sgRNA并验证无完全匹配脱靶位点。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cannabis sativa | MEP途径 | DXS1 | — | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-6-磷酸合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中6个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | DXS2 | — | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-6-磷酸合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中71个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | DXR | — | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中68个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | MCT | — | 催化 | 4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中155个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | CMK | — | 催化 | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中103个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | MDS | — | 催化 | 2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中70个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | HDS | — | 催化 | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中211个SNP |
| Cannabis sativa | MEP途径 | HDR | — | 催化 | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中76个SNP |
| Cannabis sativa | GPP途径 | IPP/IPI | — | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中50个SNP |
| Cannabis sativa | GPP途径 | GPP_LSU | — | 催化 | 牻牛儿基二磷酸合酶大亚基，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中31个SNP |
| Cannabis sativa | GPP途径 | GPP_SSU | — | 催化 | 牻牛儿基二磷酸合酶小亚基，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中19个SNP |
| Cannabis sativa | Hexanoate途径 | FAD2 | — | 催化 | 脂肪酸脱饱和酶，Cannbio-2中4个拷贝，泛基因组中各拷贝分别有57、52、53、25个SNP |
| Cannabis sativa | Hexanoate途径 | LOX | — | 催化 | 脂氧合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中133个SNP |
| Cannabis sativa | Hexanoate途径 | HPL | — | 催化 | 氢过氧化物裂解酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中200个SNP |
| Cannabis sativa | Hexanoate途径 | AAE1 | — | 催化 | 酰基激活酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中220个SNP |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | OLS | — | 催化 | 橄榄醇合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中35个SNP |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | OAC | — | 催化 | 橄榄酸环化酶，Cannbio-2中2个拷贝，泛基因组中分别有17和15个SNP |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | GOT | — | 催化 | 芳香族异戊烯基转移酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中264个SNP |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | CBDAS | — | 催化 | 大麻二酚酸合酶，Cannbio-2中9个拷贝/同源物（2个功能拷贝、3个相近同源物、4个截短） |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | THCAS | — | 催化 | Δ9-四氢大麻酚酸合酶，Cannbio-2中1个拷贝，泛基因组中37个SNP |
| Cannabis sativa | Cannabinoid途径 | CBCAS | — | 催化 | 大麻色烯酸合酶，Cannbio-2中2个拷贝及1个截短同源物，泛基因组中SNP分别为2、2、5 |
关键发现
- 在Cannbio-2基因组中鉴定出MEP途径基因DXS1和DXS2各1个拷贝，DXR、MCT、CMK、MDS、HDS、HDR各1个
- GPP途径IPP/IPI、GPP_LSU、GPP_SSU各1个
- 己酸途径FAD2有4个拷贝、LOX和HPL各1个、AAE1 1个
- 大麻素途径OLS 1个、OAC 2个、CBDAS有9个拷贝/同源物（含2个功能拷贝、3个相近同源物、4个截短）、THCAS 1个、CBCAS 2个拷贝及1个截短。在660个品种的泛基因组中鉴定出各基因SNP数量，如GOT 264个、HDS 211个、HPL 200个、AAE1 220个等。共设计145条sgRNA，经BLAST确认所有sgRNA均无20nt完全匹配的脱靶位点。
研究结论
通过本框架，可在所有植物物种（包括多倍体或高同源序列物种）中实现基于全基因组信息的基因组编辑设计，在避免脱靶的同时有效靶向大麻素生物合成途径各基因，为大麻品种改良和新型大麻素生产提供基础。