In vivo evolution of lactic acid hyper-tolerant Clostridium thermocellum
- 作者
- Roberto Mazzoli, Daniel G. Olson, Angela Maria Concu, Evert K. Holwerda, Lee R. Lynd
- 单位
- Structural and Functional Biochemistry, Laboratory of Proteomics and Metabolic Engineering of Prokaryotes, Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Torino, Via Accademia Albertina 13, 10123, Torino, Italy; Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 14 Engineering Drive, Hanover, NH, 03755, USA
- 杂志
- New Biotechnology（2021）
- DOI
- 10.1016/j.nbt.2021.12.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高 Clostridium thermocellum 对乳酸的耐受性，以实现在低 pH 条件下从木质纤维素直接发酵生产乳酸。该菌对酸敏感，pH<6.0 时不生长，乳酸耐受性低（LL1111 最大耐受约 15 g/L），严重制约其作为工业乳酸生产菌株的应用。
研究策略
采用适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution），通过逐步增加培养基中乳酸钠浓度对 C. thermocellum 野生型（LL345）和乳酸高产菌株（LL1111）进行连续传代驯化，并结合全基因组重测序鉴定与耐受性相关的突变。
研究路线图
核心内容
该研究采用适应性实验室进化策略，对野生型及乳酸高产菌株Clostridium thermocellum进行逐步提高乳酸钠浓度的连续传代驯化，并结合全基因组重测序解析耐受性机制。结果显示，乳酸高产菌株LL1111衍生的混合培养物最大耐受乳酸浓度从15 g/L提高至35 g/L，提升超过两倍；野生型衍生培养物在含45 g/L乳酸培养基中生长速率提高50–85%。基因组分析发现多个独立适应群体中ppdk（Clo1313_0949）和hprK（Clo1313_2121）基因出现趋同突变，提示二者参与乳酸耐受调控。然而，进化并未提升乳酸产率，在50 g/L纤维二糖培养中衍生株乳酸产量反下降20–40%，同时葡萄糖和丙酮酸积累增加。其中混合培养物LL1630在保持高耐受性的同时，最高乳酸滴度达9.88 g/L，与亲本LL1111相当，被认定为后续代谢工程改造的优选底盘。该工作证明了体内进化可有效突破菌株酸耐受瓶颈，但耐受性与产率间的权衡提示需结合理性改造进一步优化。
创新点
['首次通过体内进化将 C. thermocellum 的乳酸耐受性提高两倍以上（LL1111 衍生物从 15 g/L 提高到 35 g/L）', '发现 ppdk 和 hprK 基因在多个独立适应群体中出现趋同突变，提示其参与乳酸耐受机制', '获得一个兼具高乳酸耐受性和与亲本相似乳酸产量的混合培养物 LL1630，可作为进一步代谢工程改造的底盘']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum LL1111 | 乳酸发酵 | adhE | AdhE（酒精/醛脱氢酶） | 催化 | 该基因被删除（ΔadhE），以消除乙醇生产并提高乳酸产量。 |
| Clostridium thermocellum LL1111 | 乳酸发酵 | ldh（Clo1313_1160） | 乳酸脱氢酶（LDH） | 催化 | 过表达或突变消除 F1,6BP 调控，提高乳酸产量。 |
| Clostridium thermocellum LA 适应株（LL1630, LL1632, LL1633） | 丙酮酸代谢 | ppdk（Clo1313_0949） | 丙酮酸磷酸双激酶（PPDK） | 催化 | 多个亚培养中出现不同突变，可能导致功能缺失，影响碳水化合物/磷酸代谢。 |
| Clostridium thermocellum LA 适应株（LL1629, LL1634） | 碳代谢调控（PTS） | hprK（Clo1313_2121） | HPr 激酶/磷酸化酶（HPrK/P） | 调控 | 突变可能影响其结构和活性，参与碳代谢调控。 |
关键发现
- 通过适应性进化，LL1111 衍生的混合培养物最大耐受乳酸浓度从 15 g/L 提高到 35 g/L，而 LL345 衍生培养物在含 45 g/L 乳酸培养基中生长速率提高了 50–85%。LL1111 在 10 g/L 纤维二糖下最高乳酸滴度为
- 45 g/L，乙酸滴度为
- 87 g/L，最大乳酸体积生产率为
- 20–0.24 g/L/h。在 50 g/L 纤维二糖培养中，LL1111 衍生株的乳酸产量降低约 20–40%，葡萄糖和丙酮酸积累增加。在圆锥管培养中，进化株 LL1630 的最高乳酸滴度为
- 88 g/L，与亲本 LL1111 相似。基因组重测序发现 ppdk（Clo1313_0949）和 hprK（Clo1313_2121）等基因的突变。
研究结论
适应性进化显著提高了 C. thermocellum 的乳酸耐受性，但并未提高其乳酸产率；混合培养物 LL1630 因保持良好耐受性且乳酸滴度与亲本 LL1111 相当，被认为是进一步代谢工程改良的最佳平台。