High level production of amorphadiene using Bacillus subtilis as an optimized terpenoid cell factory
- 作者
- Hegar Pramastya, Dan Xue, Ingy I. Abdallah, Rita Setroikromo, Wim J. Quax
- 单位
- Department of Chemical and Pharmaceutical Biology, Groningen Research Institute of Pharmacy, University of Groningen; Pharmaceutical Biology Research Group, School of Pharmacy, Institut Teknologi Bandung; Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Alexandria University
- 杂志
- New Biotechnology（2021）
- DOI
- 10.1016/j.nbt.2020.10.007
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素前体amorphadiene在枯草芽孢杆菌中产量低，依赖植物来源导致供应不稳定，需通过代谢工程提高微生物细胞工厂产量。
研究策略
利用GFP融合增强植物来源amorphadiene合酶(ADS)的表达；染色体整合ADS与质粒表达合成MEP操纵子组合；额外表达法尼基焦磷酸合酶(FPPS)增加前体供给；采用实验设计(DoE)结合响应面法系统优化培养基。
研究路线图
核心内容
该研究以枯草芽孢杆菌168为底盘，通过多策略系统改造构建了高产青蒿素前体amorphadiene的细胞工厂。首先采用GFP融合表达策略增强植物来源amorphadiene合酶的表达，使产量较单独表达ADS提高2倍；继而将完整MEP操纵子整合至染色体并与质粒表达的ADS组合，产量提升约4倍；额外表达法尼基焦磷酸合酶进一步增加前体供给，使单位细胞产量达3.40 mg/L/OD。随后利用实验设计与响应面法系统优化培养基成分，产量从83 mg/L提升至258±6 mg/L。最终构建的cGAF/SDFHCEGA菌株在优化培养基中amorphadiene产量达416±15 mg/L，是此前报道枯草芽孢杆菌最高产量的20倍以上，也超过大肠杆菌和酿酒酵母摇瓶水平的两倍。此外研究还发现约37%产物积累于胞内。该工作通过蛋白融合表达、通路整体过表达与培养基优化的协同策略，将枯草芽孢杆菌开发为高效的萜类细胞工厂，为青蒿素半合成及其他萜类化合物的微生物生产奠定了重要基础。
创新点
首次在枯草芽孢杆菌中采用GFP融合显著提高ADS表达；将全MEP通路基因与FPPS共表达；通过响应面法优化培养基使产量大幅提升；发现并量化了胞内amorphadiene积累。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ads | amorphadiene synthase (ADS) | 催化 | 催化FPP环化生成amorphadiene，是青蒿素生物合成的限速步骤 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | gfp-ads | GFP-ADS融合蛋白 | 催化 | GFP融合增强ADS表达和稳定性，产量较单独ADS提高2倍 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | fpps | farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP/DMAPP缩合形成FPP，增强前体供给 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (Dxs) | 催化 | MEP途径第一个酶，催化DXP合成 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispC | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (Dxr/IspC) | 催化 | 催化DXP转化为MEP |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispD | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (IspD) | 催化 | 催化MEP生成CDP-ME |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispE | 4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE) | 催化 | 催化CDP-ME磷酸化 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispF | 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (IspF) | 催化 | 催化CDP-MEP环化生成MEC |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispG | (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase (IspG) | 催化 | 催化HMBPP生成 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispH | 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (IspH) | 催化 | 催化HMBPP还原为IPP和DMAPP |
| Bacillus subtilis 168 | MEP pathway | ispA | geranyl/farnesyl pyrophosphate synthase (IspA) | 催化 | 内源IPP/DMAPP缩合酶，同时具有GPP和FPP合酶活性 |
关键发现
- 构建的cGAF/SDFHCEGA菌株在优化培养基(OPT)中amorphadiene产量达416±15 mg/L，是此前报道的B. subtilis产量的20倍以上，是E. coli或S. cerevisiae摇瓶产量的两倍多
- GFP-ADS融合使ADS蛋白表达显著增强，amorphadiene产量较ADS单独表达提高2倍（0.78 vs 0.35 mg/L/OD）
- 共表达全MEP操纵子使产量提高约4倍（cGA/SDFHCEGA为2.74 mg/L/OD vs cGA）
- 额外表达FPPS后产量进一步达3.40 mg/L/OD（42.50 mg/L）
- 优化培养基后从83 mg/L提升至258±6 mg/L（预测245 mg/L）
- 10 mL培养中检测到胞内amorphadiene 150 mg/L，胞外约260 mg/L
- 质粒稳定性：cGAF 100%保持40代，SDFHCEGA 90%保持40代。
研究结论
通过GFP融合、MEP通路整体过表达、FPPS共表达及培养基优化，成功将枯草芽孢杆菌开发为高效amorphadiene细胞工厂，产量416±15 mg/L为目前该菌中最高报道，为青蒿素半合成及萜类生产提供基础。