Heterologous production of β-pinene in the chloroplast of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum
- 作者
- Nicola Trevisan, Michele Fabris, John van der Oost, Maria Barbosa, Sarah D'Adamo
- 单位
- Bioprocess Engineering, Wageningen University, Wageningen 6708 PB, the Netherlands; SDU Biotechnology, Faculty of Engineering, University of Southern Denmark, Campusvej 55, Odense M DK-5230, Denmark; SDU Climate Cluster, Faculty of Science, University of Southern Denmark, Campusvej 55, Odense M DK-5230, Denmark; Laboratory of Microbiology, Wageningen University, Wageningen 6708 WE, the Netherlands
- 杂志
- New Biotechnology（2025）
- DOI
- 10.1016/j.nbt.2025.10.003
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在海洋硅藻 Phaeodactylum tricornutum 中异源生产 β-蒎烯，探讨叶绿体 MEP 途径与胞质 MVA 途径哪个更能为单萜合成提供前体，并比较附加体表达与随机染色体整合对产量的影响。
研究策略
通过细菌接合实现附加体表达、电穿孔实现随机染色体整合，分别在胞质和叶绿体中表达来自 Abies grandis 和 Citrus limon 的蒎烯合酶（PinS），利用叶绿体靶向肽（atpC CTP）定位，以肉豆蔻酸异丙酯（IM）原位萃取，GC-MS 定量检测 α-蒎烯和 β-蒎烯。
核心内容
本研究在海洋硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中实现了β-蒎烯的异源生产，系统比较了叶绿体MEP途径与胞质MVA途径对单萜前体供给的贡献，并评估了附加体表达与随机染色体整合两种策略的产量差异。通过细菌接合和电穿孔分别实现附加体表达与染色体整合，将来自大冷杉和柠檬的蒎烯合酶（AgPinS、ClPinS）靶向叶绿体或定位于胞质，以肉豆蔻酸异丙酯原位萃取并结合GC-MS定量。结果显示，叶绿体定位的附加体表达株系（EE_CTP_AgPinS）β-蒎烯最高产量仅为3.27 μg·L⁻¹，而胞质定位株系未检测到蒎烯；随机染色体整合株系（RICE_CTP_AgPinS）产量可达19.35 μg·L⁻¹，较附加体株系提高约3倍，RICE_CTP_ClPinS株系亦达20.07 μg·L⁻¹。体外酶活实验证实胞质中酶未失活，说明叶绿体定位对利用MEP途径前体至关重要。各株系生长与野生型无显著差异。该研究首次证明叶绿体靶向表达蒎烯合酶是硅藻合成单萜的关键策略，随机整合可显著提升产量，为微藻光合生产萜类化合物奠定了方法基础。
创新点
['首次在硅藻 P. tricornutum 叶绿体中异源表达蒎烯合酶并成功生产 β-蒎烯', '系统比较了胞质与叶绿体定位对单萜合成的影响', '利用附加体表达与随机染色体整合两种策略，证明后者可显著提高产量']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | — | — | — | — | 模式海洋硅藻，天然同时具有叶绿体 MEP 途径和胞质 MVA 途径，不天然产生单萜 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | MEP pathway (叶绿体) | — | — | — | 叶绿体中的萜类前体合成途径，提供 IPP/DMAPP，是本研究实现 β-蒎烯合成的主要前体来源 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | MVA pathway (胞质) | — | — | — | 胞质中的萜类前体合成途径，本研究尝试利用其前体但未检测到蒎烯产物 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | MEP pathway | AgPinS | pinene synthase from Abies grandis | 催化 | 催化 GPP 环化生成蒎烯，叶绿体定位时产 β-蒎烯，胞质定位时未检测到产物但体外有活性 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | MEP pathway | ClPinS | pinene synthase from Citrus limon | 催化 | 催化 GPP 环化生成蒎烯，随机整合叶绿体定位时获得最高 β-蒎烯产量 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | — | atpC CTP | chloroplast transit peptide from ATP synthase γ subunit | 区室化 | 用于将异源蛋白靶向至叶绿体，融合后确证蛋白定位 |
| Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1 | — | mNeonGreen (mNG) | mNeonGreen fluorescent protein | 调控 | 荧光报告蛋白，用于验证亚细胞定位，不直接参与代谢 |
关键发现
- ['叶绿体定位的附加体表达（EE_CTP_AgPinS）最高 β-蒎烯产量为
- 27±0.64 μg·L⁻¹（0.98±0.13 ng·10⁻⁷ cells），而胞质定位的 EE_AgPinS 未检测到蒎烯', '随机染色体整合的 RICE_CTP_AgPinS 10 株系 β-蒎烯产量达
- 35±1.42 μg·L⁻¹（7.88±0.85 ng·10⁻⁷ cells），总蒎烯（α+β）为
- 91±1.92 μg·L⁻¹，比相应附加体株系高约 3 倍', '随机染色体整合的 RICE_CTP_ClPinS 6 株系 β-蒎烯产量达
- 07±0.51 μg·L⁻¹（7.49±0.48 ng·10⁻⁷ cells）', '所有产蒎烯株系均同时产生 α-蒎烯作为副产物，α-蒎烯占总单萜的 20-25%（α:β 约为 23:77 至 25:75）', '体外粗酶实验证实，无论定位在胞质还是叶绿体，AgPinS 均能催化 GPP 转化为蒎烯，说明胞质中未检测到产物并非酶失活', '各转基因株系与野生型的生长曲线无显著差异，表明质粒维持、蒎烯合成和抗生素筛选未造成明显代谢负担']
研究结论
本研究证明将蒎烯合酶靶向 P. tricornutum 叶绿体是利用 MEP 途径前体合成 β-蒎烯的关键，随机染色体整合比附加体表达能获得更高且更稳定的产量。虽然目前产量尚未达到商业竞争力（最高约 20 μg·L⁻¹），但该研究为微藻光合生产单萜类化合物奠定了基础，提示未来可通过增强 GPP 供给、优化酶催化效率及改进挥发物回收方法来提高产量。