Coenzyme precursor-assisted cooperative overexpression of an active pyridoxine 4-oxidase from Microbacterium luteolum
- 作者
- Yu Yoshikane, Nana Yokochi, Kouhei Ohnishi, Toshiharu Yagi
- 单位
- Department of Bioresources Science, Faculty of Agriculture, Kochi University, Monobe-Otsu 200, Nankoku, Kochi 783-8502, Japan; Research Institute of Molecular Genetics, Kochi University, Monobe-Otsu 200, Nankoku, Kochi 783-8502, Japan
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2003）
- DOI
- 10.1016/j.pep.2003.11.013
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现Microbacterium luteolum来源的吡哆醇4-氧化酶在大肠杆菌中的高效可溶表达，解决原有表达系统比活性低（仅比M. luteolum高5倍）、包涵体形成等问题。
研究策略
采用共表达分子伴侣GroEL/ES、低温（23°C）冷应激培养以及在培养基中添加辅酶FAD前体核黄素的协同策略，提高可溶性活性酶的表达量。
核心内容
该研究针对Microbacterium luteolum来源的吡哆醇4-氧化酶在大肠杆菌中高效可溶表达困难、原有系统比活性低的问题，提出了一种辅酶前体辅助的协同过表达策略。作者将共表达分子伴侣GroEL/ES、23°C低温冷应激培养以及在培养基中添加辅酶FAD前体核黄素三者相结合，在JM109/pTPNO3/pKY206菌株中实现了活性酶的高水平表达。结果显示，当在含50 μM核黄素的LB培养基中于23°C培养时，粗提物比活性较M. luteolum提高了88倍；共表达GroEL/ES使比活性提升3.9倍，达到3.0±0.81 U/mg，而添加核黄素进一步使比活性提高2.1倍，可溶形式增加1.5倍，且可溶形式比例与比活性呈显著正相关（R²=0.70）。最终从1.0 g湿细胞纯化获得8.8 mg纯酶，回收率42%，比活性达23 U/mg。该协同表达系统显著提升了活性酶的产量与纯度，简化了纯化流程，所得酶适用于结晶研究及吡哆醇检测应用。
创新点
首次报道辅酶前体辅助的协同过表达系统，将分子伴侣共表达、冷应激和辅酶前体补充相结合，显著提高活性吡哆醇4-氧化酶的表达水平，并简化纯化步骤。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109（及BL21(DE3)） | 吡哆醇降解途径I | pyridoxine 4-oxidase基因（未命名） | Pyridoxine 4-oxidase | 催化 | 来源于Microbacterium luteolum，FAD依赖性，催化吡哆醇氧化为吡哆醛 |
| Escherichia coli（JM109） | — | groEL/groES | GroEL/GroES | 调控 | 分子伴侣，共表达促进重组酶正确折叠，需与冷应激协同 |
关键发现
- 在含50 μM核黄素的LB培养基中、23°C冷应激下，JM109/pTPNO3/pKY206细胞粗提物比活性较M. luteolum提高88倍
- 共表达GroEL/ES使比活性提高3.9倍（达3.0±0.81 U/mg）
- 添加核黄素使比活性提高2.1倍，可溶形式增加1.5倍
- 可溶形式比例与比活性显著相关（R²=0.70）。纯化后从1.0 g湿细胞获得8.8 mg纯酶，回收率42%，纯化5.6倍，比活性23 U/mg。
研究结论
建立了辅酶前体辅助的协同过表达系统，通过共表达GroEL/ES、冷应激和添加核黄素，可高效表达活性吡哆醇4-氧化酶，纯化简便，所得酶可用于结晶和吡哆醇检测。