Cholesterol oxidase from Rhodococcus erythropolis with high specificity toward β-cholestanol and pytosterols
- 作者
- Noriyuki Doukyu, Makoto Ishikawa
- 单位
- Department of Life Sciences, Toyo University; Graduate School of Life Sciences, Toyo University; Bio-Nano Electronic Research Center, Toyo University
- 杂志
- PLoS ONE（2020）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0241126
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
发现并表征红城红球菌PR4中两个VAO家族胆固醇氧化酶，特别是对β-cholestanol和植物甾醇具有高活性的ChoRII，并阐明其酶学特性与催化产物
研究策略
基于基因组序列克隆两个胆固醇氧化酶基因choRI和choRII，在大肠杆菌中异源表达并纯化，系统表征其pH/热稳定性、底物特异性、动力学参数，并通过NMR鉴定胆固醇氧化产物
核心内容
红城红球菌PR4基因组中克隆到两个VAO家族胆固醇氧化酶基因choRI和choRII，并在大肠杆菌中异源表达纯化。ChoRI和ChoRII分别纯化225倍和132倍，比活力为8.7和0.40 U/mg，对胆固醇的Km值分别为22.6 μM和22.1 μM。ChoRII表现出独特的底物偏好，对β-cholestanol、β-sitosterol和stigmasterol的相对活性分别为胆固醇的235%、210%和171%，是首个对植物甾醇活性高于胆固醇的胆固醇氧化酶。ChoRI最适温度45°C，在pH 4.5-10稳定；ChoRII最适温度55°C，在pH 4.5-10.5稳定。NMR鉴定显示ChoRI氧化胆固醇生成cholest-4-en-3-one，而ChoRII生成6β-hydroperoxycholest-4-en-3-one，表明同一菌株中两个酶催化产物不同。ChoRII对β-cholestanol和植物甾醇的高活性使其在脑腱黄瘤病诊断及植物甾醇检测中具有潜在应用价值。
创新点
首次报道对β-cholestanol、β-sitosterol和stigmasterol的活性分别高于胆固醇2.4、2.1、1.7倍的胆固醇氧化酶ChoRII；发现同一菌株的两个VAO家族酶分别产生cholest-4-en-3-one和6β-hydroperoxycholest-4-en-3-one
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis PR4 | 胆固醇降解 | choRI | ChoRI | 催化 | 产生cholest-4-en-3-one |
| Rhodococcus erythropolis PR4 | 胆固醇降解 | choRII | ChoRII | 催化 | 产生6β-hydroperoxycholest-4-en-3-one；对β-cholestanol活性为胆固醇的2.4倍 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 异源表达 | choRI | ChoRI | 催化 | 重组蛋白表达与纯化 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 异源表达 | choRII | ChoRII | 催化 | 重组蛋白表达与纯化 |
关键发现
- ChoRI和ChoRII分别纯化225倍和132倍，比活力为8.7和0.40 U/mg；Km值分别为22.6 μM和22.1 μM，Vmax分别为6.4和0.57 μmol/min/mg；ChoRII对β-cholestanol、β-sitosterol、stigmasterol的相对活性分别为235%、210%、171%；ChoRI最适温度45°C，ChoRII为55°C；ChoRI在pH
- 5-10稳定，ChoRII在pH
- 5-10.5稳定；ChoRI氧化胆固醇生成cholest-4-en-3-one，ChoRII生成6β-hydroperoxycholest-4-en-3-one
研究结论
红城红球菌PR4拥有两个VAO家族胆固醇氧化酶，其中ChoRII优先氧化β-cholestanol和植物甾醇，可能用于脑腱黄瘤病诊断及植物甾醇检测，具有潜在应用价值