Expression of HBsAg and preS2-S protein in different yeast based system: A comparative analysis
- 作者
- Nadia Hadiji-Abbes, Istabrak Borchani-Chabchoub, Henda Triki, Radhouane Ellouz, Ali Gargouri, Raja Mokdad-Gargouri
- 单位
- Unité de Génétique du Cancer et Production de Protéines Thérapeutiques, Centre de Biotechnologie de Sfax, Route Sidi Mansour, B.P. 1177 Sfax, Tunisia; Laboratoire de Virologie, Institut Pasteur de Tunis, 13 place Pasteur, B.P. 74, 1002 Tunis Belvédère, Tunisia
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2009）
- DOI
- 10.1016/j.pep.2009.03.006
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
比较不同酵母表达系统（酿酒酵母和毕赤酵母）中乙型肝炎病毒小表面抗原（S蛋白）和中等表面抗原（preS2-S/M蛋白）的表达水平，寻找小规模生产重组乙肝疫苗抗原的最适系统。
研究策略
在酿酒酵母中分别使用诱导型Gal10/cyc1启动子和组成型PGK启动子，通过2μ复制型载体表达S和preS2-S基因；在毕赤酵母中使用甲醇诱导型AOX1启动子，在Mut+（GS115）和MutS（KM71）两种遗传背景下表达，并考察基因拷贝数、碳源及双启动子共表达对产量的影响。
核心内容
该研究系统比较了酿酒酵母与毕赤酵母两种表达系统生产乙肝表面抗原（HBsAg）S蛋白和preS2-S蛋白的能力。在酿酒酵母中，分别采用诱导型Gal10/cyc1启动子和组成型PGK启动子通过2μ载体表达目标基因，结果显示诱导型启动子优于组成型，S蛋白和preS2-S产量分别达14.27 mg/l和10.9 mg/l。进一步构建同时携带两种表达载体的共表达菌株，使S蛋白产量提升至18.31 mg/l，preS2-S达13.22 mg/l。在毕赤酵母中，考察了Mut+与MutS遗传背景、基因拷贝数和碳源的影响，发现单拷贝MutS菌株的HBsAg产量约为Mut+菌株的2.5至3倍，而携带3拷贝S基因的菌株产量又约为单拷贝的3倍，最佳碳源为乙醇。结果表明，在小规模生产中酿酒酵母比毕赤酵母更适于乙肝疫苗抗原的生产，且双启动子共表达策略能有效提高产量，为重组乙肝疫苗的制备提供了参考依据。
创新点
['首次在同一宿主菌株、复制起点和转录终止子条件下，比较诱导型Gal10/cyc1与组成型PGK启动子对S和preS2-S蛋白表达的影响', '构建了同时含有诱导型和组成型表达载体的酿酒酵母共表达菌株（UTS和UTP），显著提高抗原产量', '系统比较了P. pastoris Mut+与MutS遗传背景及基因拷贝数对HBsAg产量的影响']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae W303-1B | 重组乙肝表面抗原表达 | — | — | 区室化 | 宿主菌，提供真核蛋白折叠和组装环境，用于S和preS2-S基因表达 |
| 毕赤酵母 Pichia pastoris GS115 (Mut+) | 重组乙肝表面抗原表达 | — | — | 区室化 | 甲醇利用正常型宿主，用于AOX1启动子驱动的S和preS2-S基因表达 |
| 毕赤酵母 Pichia pastoris KM71 (MutS) | 重组乙肝表面抗原表达 | — | — | 区室化 | 甲醇利用慢型宿主，用于AOX1启动子驱动的S和preS2-S基因表达，产量高于Mut+ |
| 大肠杆菌 Escherichia coli TOP10 | 质粒克隆与构建 | — | — | 能量供给 | 用于重组质粒的克隆和扩增 |
| — | 基因表达调控 | GAL10/CYC1启动子 | — | 调控 | 酿酒酵母中半乳糖诱导型启动子，控制S和preS2-S基因转录 |
| — | 基因表达调控 | PGK启动子 | — | 调控 | 酿酒酵母中磷酸甘油酸激酶组成型启动子，控制S和preS2-S基因转录 |
| — | 基因表达调控 | AOX1启动子 | — | 调控 | 毕赤酵母中甲醇诱导型启动子，控制S和preS2-S基因转录 |
| — | 乙肝病毒包膜蛋白合成 | S基因 | HBsAg S蛋白（226 aa） | 区室化 | 乙肝病毒小表面抗原，需组装成20-22nm颗粒才具有免疫原性 |
| — | 乙肝病毒包膜蛋白合成 | preS2-S基因 | preS2-S/M蛋白（281 aa） | 区室化 | 乙肝病毒中等表面抗原，含preS2区段，可增强免疫应答并减少无应答者比例 |
关键发现
- 酿酒酵母中，S蛋白产量在诱导型条件下为14.27 mg/l、preS2-S为10.9 mg/l
- 组成型条件下分别为9.18 mg/l和6.39 mg/l。共表达菌株UTS（S蛋白）产量达到18.31 mg/l，UTP（preS2-S）达到13.22 mg/l。毕赤酵母中，单拷贝MutS菌株SK3的HBsAg产量约为Mut+菌株SG9的2.5-3倍
- 携带3拷贝S基因的SK4菌株产量约为单拷贝SK3的3倍。最佳碳源为乙醇。
研究结论
小规模实验中，酿酒酵母比毕赤酵母更适合HBsAg和preS2-S蛋白的生产；在酿酒酵母中，诱导型Gal10/cyc1启动子优于组成型PGK启动子；通过双启动子共表达可进一步提高目标蛋白产量。