高级醇 · 代谢工程文献库

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Isolation and functional analysis of two Cistus creticus cDNAs encoding geranylgeranyl diphosphate synthase

作者
Irene Pateraki, Angelos K. Kanellis
单位
Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants, Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 Thessaloniki, Greece
杂志
Phytochemistry（2008）
DOI
10.1016/j.phytochem.2008.02.005
所属领域
代谢工程
关键词
克里特岩蔷薇（Cistus creticus ssp. creticus）半日花烷型二萜次生代谢牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGDPS）萜类生物合成
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解决的核心问题

克里特岩蔷薇（Cistus creticus）叶片腺毛分泌的树脂'岩蔷薇'中含有多种具有抗癌活性的半日花烷型二萜，但其生物合成上游关键酶牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGDPS）的分子特征和表达调控尚不清楚。

研究策略

利用RACE技术克隆两个GGDPS全长cDNA；通过序列比对和系统发育分析预测蛋白特征；在酿酒酵母ANY119突变体中进行异源功能互补验证；制备多克隆抗体并结合Western blot和RT-PCR分析不同组织及不同发育阶段叶片的表达模式。

研究路线图

100%
克里特岩蔷薇GGDPS分子特征与调控不明
RACE技术克隆全长cDNA
序列比对与系统发育分析
酵母ANY119异源功能互补
多克隆抗体+Western blot/RT-PCR
两基因编码363/369个氨基酸，一致性74%
全长和成熟蛋白恢复酵母生长
毛状体和幼叶高表达，受发育调控
GGDPS催化活性明确，表达受转录调控，为代谢工程奠定基础
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核心内容

该研究首次从克里特岩蔷薇中克隆并功能鉴定了两个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGDPS）的cDNA，分别命名为CcGGDPS1和CcGGDPS2。前者全长1456 bp，编码363个氨基酸；后者全长1311 bp，编码369个氨基酸，两者氨基酸序列一致性为74%，与已知植物GGDPS的一致性范围为53%–73%。通过酿酒酵母ANY119突变体异源功能互补实验，表达全长或推定成熟蛋白的细胞在37°C下半乳糖/棉子糖培养基中均能恢复生长，证实了这两个基因具有催化活性。组织表达分析显示，CcGGDPS1/2转录本在毛状体中积累量最高，叶片次之，根和种子中极低；发育阶段分析表明最小叶片（0.5–1.0 cm）中转录本和蛋白含量最高，随叶龄增大逐渐下降。上述结果揭示GGDPS表达具有组织和发育阶段特异性，且主要在转录水平受调控，为理解克里特岩蔷薇二萜生物合成的分子机制及后续代谢工程改造奠定了基础。

创新点

['首次在分子水平上研究克里特岩蔷薇的萜类生物合成；', '克隆并功能鉴定了两个新的GGDPS cDNA（CcGGDPS1和CcGGDPS2）；', '揭示了GGDPS在毛状体和最小叶片中高表达且受转录调控。']

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae ANY119 类异戊二烯/二萜生物合成 CcGGDPS1 CcGGDPS1 催化 全长cDNA（GenBank: AF492022）编码363 aa；异源表达可互补GGTase缺陷突变体bet2-1，证明具有GGDPS酶活性。
Saccharomyces cerevisiae ANY119 类异戊二烯/二萜生物合成 CcGGDPS2 CcGGDPS2 催化 全长cDNA（GenBank: AF492023）编码369 aa；异源表达可互补GGTase缺陷突变体bet2-1，证明具有GGDPS酶活性。
Escherichia coli BL21(DE3) 重组蛋白表达 CcGGDPS1片段（编码C端192 aa） 重组CcGGDPS1 C端肽段（6xHis标签） 催化 该重组蛋白用于免疫兔子制备多克隆抗体。
Cistus creticus ssp. creticus 二萜生物合成（labdane型二萜） CcGGDPS1和CcGGDPS2 CcGGDPS1/CcGGDPS2 催化 在毛状体和最小叶片（0.5–1.0 cm）中表达量最高，根和种子中极低；表达受发育调控。

关键发现

  1. ['CcGGDPS1 cDNA全长1456 bp，编码363个氨基酸
  2. CcGGDPS2 cDNA全长1311 bp，编码369个氨基酸
  3. 两者氨基酸序列一致性为74%。', '预测的成熟蛋白（去掉转运肽后）大小约为31.7 kDa，成熟肽之间一致性达85%。', '与已知植物GGDPS的氨基酸一致性范围为53%–73%。', '在酵母ANY119功能互补实验中，表达全长（FL1/2）和推定成熟（M1/2）蛋白的细胞在37°C下于半乳糖/棉子糖培养基中均能恢复生长，而截短体（T1/2）不能
  4. 其中M1/2蛋白表达量最高。', '组织表达分析显示，毛状体中CcGGDPS1/2转录本积累量最高，其次为叶片、花芽和茎，根和种子中极低。', '叶片发育阶段分析表明，最小叶片（0.5–1.0 cm）中转录本和蛋白含量最高，随叶龄增大（1–2 cm、2–3 cm、≥3 cm）逐渐下降。', '制备的多克隆抗体能特异性识别重组和天然CcGGDPS蛋白，未与其他蛋白交叉反应。']

研究结论

CcGGDPS1和CcGGDPS2是具有催化活性的GGDPS，其表达在组织和发育阶段具有特异性，且主要在转录水平受到调控，为克里特岩蔷薇二萜生物合成的分子机制和未来代谢工程改造奠定了基础。