Cloning and characterization of two different types of geranyl diphosphate synthases from Norway spruce (Picea abies)
- 作者
- Axel Schmidt, Jonathan Gershenzon
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Department of Biochemistry, Hans-Knöll-Strasse 8, D-07745 Jena, Germany
- 杂志
- Phytochemistry（2007）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2007.06.022
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示挪威云杉中两种不同类型香叶基二磷酸合酶（GPPS）的基因克隆、酶学特征及生理功能，并探究其在植物单萜生物合成中的作用。
研究策略
基于已知植物GPPS保守区域设计简并引物，通过RT-PCR和cDNA文库筛选从挪威云杉中克隆两个GPPS基因（PaIDS2和PaIDS3），并在大肠杆菌中异源表达纯化重组蛋白；结合系统发育分析、体外酶活测定和甲基茉莉酸（MJ）处理后的基因表达分析，阐明其功能分工。
核心内容
该研究从挪威云杉中克隆并鉴定了两种不同类型的香叶基二磷酸合酶基因PaIDS2和PaIDS3。通过RT-PCR和cDNA文库筛选获得基因序列后，在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，结合系统发育分析、体外酶活测定及甲基茉莉酸处理后的表达分析，揭示其功能分工。结果表明，PaIDS2编码386个氨基酸蛋白，体外专一生成GPP，且在茉莉酸甲酯处理后转录水平在树皮中第10天升高120倍，表明其参与诱导型树脂单萜合成。PaIDS3编码427个氨基酸蛋白，体外产物混杂（42% GPP、33% FPP、25% GGPP），且不受茉莉酸甲酯诱导，可能定位于线粒体并具有不同代谢功能。该研究首次在单一植物中发现两种不同进化枝的同源二聚体GPPS，挑战了PaIDS3作为专一GPP合酶的注释，为理解植物单萜生物合成的复杂调控提供了新视角。
创新点
首次在单一植物物种中发现两种不同进化枝的同源二聚体GPPS；发现PaIDS3及其栎树同源物QrIDS1在体外除GPP外还产生大量FPP和GGPP，挑战了其作为专一GPP合酶的功能注释；提出PaIDS2参与诱导型树脂单萜合成，而PaIDS3可能定位于线粒体并具有不同的代谢功能。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Picea abies | 单萜生物合成/异戊二烯焦磷酸代谢 | PaIDS2 | PaIDS2 | 催化 | 香叶基二磷酸合酶，体外专一催化IPP和DMAPP生成GPP；异源表达于E. coli；MJ强烈诱导表达，参与创伤树脂道单萜形成。 |
| Picea abies | 异戊二烯焦磷酸代谢 | PaIDS3 | PaIDS3 | 催化 | 香叶基二磷酸合酶，体外同时产生GPP、FPP和GGPP；序列与拟南芥GPPS相似，预测定位于线粒体；MJ处理不诱导其表达。 |
| Quercus robur | 异戊二烯焦磷酸代谢 | QrIDS1 | QrIDS1 | 催化 | 与PaIDS3同源，体外产物为55% GPP和45% FPP，不产生GGPP。 |
| Escherichia coli | 重组蛋白表达 | PaIDS2, PaIDS3, QrIDS1 | 重组蛋白 | 催化 | 作为异源表达宿主用于酶功能鉴定，空载体对照无活性。 |
关键发现
- PaIDS2编码386个氨基酸蛋白（42.2 kDa），PaIDS3编码427个氨基酸蛋白（47.7 kDa），QrIDS1编码416个氨基酸蛋白（46.2 kDa）。PaIDS2与PaIDS3成熟蛋白序列一致性仅约20%。PaIDS2体外以DMAPP和IPP为底物专一生成GPP
- PaIDS3体外产物组成为42% GPP、33% FPP、25% GGPP
- QrIDS1产物为55% GPP、45% FPP。MJ处理后，PaIDS2在树皮中第10天转录水平升高120倍，在木质部中第1天升高12倍
- PaIDS3表达不受MJ诱导。
研究结论
挪威云杉含有两种不同类型GPPS：PaIDS2属于裸子植物型，受MJ强烈诱导，参与诱导型树脂单萜生物合成；PaIDS3属于被子植物型，体外产物混杂且不受MJ诱导，可能并非以单萜合成为主要功能，其在体内可能生成GPP以外的产物或定位于其他亚细胞区室。