Over-expression of Arabidopsis thaliana carotenoid hydroxylases individually and in combination with a β-carotene ketolase provides insight into in vivo functions
- 作者
- Ji-Eun Kim, Kimberly M. Cheng, Neal E. Craft, Björn Hamberger, Carl J. Douglas
- 单位
- Department of Animal Science, University of British Columbia; Craft Technologies, Inc.; Department of Botany, University of British Columbia
- 杂志
- Phytochemistry（2009）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2009.10.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究拟南芥类胡萝卜素羟化酶（AtB1、CYP97A3、CYP97B3、CYP97C1）在α-胡萝卜素和β-胡萝卜素环羟化中的体内功能，以及这些羟化酶与β-胡萝卜素酮化酶bkt1共表达时对酮类类胡萝卜素生成和类胡萝卜素代谢流的影响。
研究策略
构建由双CaMV35S启动子驱动的单羟化酶基因（AtB1、CYP97A3、CYP97B3、CYP97C1）及与雨生红球藻bkt1酮化酶共转化的拟南芥转基因株系，通过RT-PCR检测转基因表达水平，利用HPLC对叶片类胡萝卜素谱（21种包括异构体）进行定性和定量分析，比较各株系与野生型的代谢物变化。
核心内容
该研究通过在拟南芥中分别过表达四个类胡萝卜素羟化酶基因（AtB1、CYP97A3、CYP97B3、CYP97C1），并单独或与雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt1共转化，利用HPLC对叶片中21种类胡萝卜素及其异构体进行定量分析，以解析各羟化酶的体内功能及酮化酶对其代谢流的影响。结果显示，AtB1过表达显著提升β-分支产物含量，如反式紫黄质由14.7 μg/g升至31.0 μg/g、反式新黄质由14.3 μg/g升至30.6 μg/g；CYP97A3和CYP97C1过表达均使α-胡萝卜素含量下降，同时玉米黄质增加；CYP97B3过表达使α-胡萝卜素降至0.79 μg/g并引起多种隐黄素减少，首次提供了其参与类胡萝卜素代谢的体内证据。所有株系均未检测到酮类胡萝卜素，而bkt1与AtB1共表达反而消除了AtB1单独过表达带来的β-分支产物累积效应，并改变α-胡萝卜素衍生物模式。该结果表明酮化酶与羟化酶之间存在代谢互作，可影响类胡萝卜素分支途径的碳流分配，提示在代谢工程中需考虑修饰酶间的协同调控。
创新点
首次通过体内过表达验证CYP97B3参与类胡萝卜素代谢；发现羟化酶与bkt1共表达并未积累酮类胡萝卜素，而是意外改变α-胡萝卜素衍生物模式，揭示β-胡萝卜素酮化酶与羟化酶之间可能存在代谢互作并影响碳流向分配。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana Col-0) | 类胡萝卜素生物合成 | AtB1 (At4g25700) | β-胡萝卜素羟化酶AtB1 | 催化 | 非血红素双铁羟化酶，主要催化β-胡萝卜素β-环羟化；过表达使β-胡萝卜素途径产物显著增加，并降低α-隐黄素。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana Col-0) | 类胡萝卜素生物合成 | CYP97A3 (At1g31800) | 细胞色素P450单加氧酶CYP97A3 | 催化 | 主要羟化α-胡萝卜素的β-环，对β-胡萝卜素β-环有次要活性；过表达降低α-胡萝卜素、增加玉米黄素。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana Col-0) | 类胡萝卜素生物合成 | CYP97B3 (At4g15110) | 细胞色素P450单加氧酶CYP97B3 | 催化 | 此前未表征的候选羟化酶，过表达影响α-胡萝卜素及其衍生物和β-隐黄素水平，可能为β-环羟化酶。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana Col-0) | 类胡萝卜素生物合成 | CYP97C1 (At3g53130) | 细胞色素P450单加氧酶CYP97C1 | 催化 | 主要催化α-胡萝卜素ε-环羟化，也具有β-环羟化活性；过表达降低α-胡萝卜素和β-隐黄素，增加玉米黄质。 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana Col-0) | 类胡萝卜素生物合成 | bkt1 (CrtO) | β-胡萝卜素酮化酶Bkt1 | 催化 | 来自雨生红球藻，在转基因拟南芥中单独或与羟化酶共表达均未检测到酮类胡萝卜素积累，但单独表达时降低α-胡萝卜素水平。 |
关键发现
- AtB1过表达使β-胡萝卜素途径产物显著增加：β-隐黄素0.51 μg/g（WT
- 39）、玉米黄素1.58 μg/g（WT
- 79）、反式紫黄质31.0 μg/g（WT
- 7）、顺式紫黄质6.45 μg/g（WT
- 60）、反式新黄质30.6 μg/g（WT
- 3）。CYP97A3过表达使α-胡萝卜素降至0.84 μg/g（WT
- 27），玉米黄素升至1.62 μg/g（约2倍）。CYP97B3过表达使α-胡萝卜素降至0.79 μg/g、α-隐黄素降至0.16 μg/g、β-隐黄素降至0.22 μg/g、玉米黄质（zeinoxanthin）升至0.40 μg/g（WT
- 24）。CYP97C1过表达使α-胡萝卜素降至0.79 μg/g、玉米黄质（zeinoxanthin）升至0.39 μg/g、β-隐黄素降至0.28 μg/g。所有转基因株系中均未检测到酮类胡萝卜素（海胆酮、角黄素、虾青素等）。bkt1单独表达使α-胡萝卜素降至0.72 μg/g。AtB1与bkt1共表达消除了AtB1引起的β-胡萝卜素衍生物增加，使α-胡萝卜素降至0.84 μg/g、玉米黄质（zeinoxanthin）升至0.34 μg/g。
研究结论
研究确认了AtB1、CYP97A3和CYP97C1在类胡萝卜素羟化中的已知功能，并提供CYP97B3可能作为β-环羟化酶参与类胡萝卜素代谢的新证据；过表达羟化酶可改变类胡萝卜素代谢流，但效果多数温和。与bkt1共表达未能产生酮类胡萝卜素，反而引起α-胡萝卜素途径的意外变化，表明酮化酶与羟化酶间存在相互作用，可能影响类胡萝卜素分支途径的碳流分配，提示需进一步研究修饰途径的酶学调控以实现合理的代谢工程。