Identification and characterization of two bisabolene synthases from linear glandular trichomes of sunflower (Helianthus annuus L., Asteraceae)
- 作者
- Anna-Katharina Aschenbrenner, Moonhyuk Kwon, Jürgen Conrad, Dae-Kyun Ro, Otmar Spring
- 单位
- Institute of Botany, University of Hohenheim; Department of Biological Sciences, University of Calgary; Bioorganic Chemistry, University of Hohenheim
- 杂志
- Phytochemistry（2016）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2016.01.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
向日葵的线性腺毛（LGT）中积累双没药烯型倍半萜，但其生物合成第一步所需的双没药烯合酶尚未鉴定。本研究旨在从LGT转录本中发现并功能表征催化FPP生成γ-双没药烯的酶。
研究策略
以拟南芥（Z）-γ-双没药烯合酶AtTPS12为查询序列，通过BLAST搜索向日葵EST数据库获得候选基因片段；设计引物从LGT的cDNA中PCR扩增全长ORF；在工程酵母EPY300中异源表达候选基因，利用GC-MS和NMR鉴定产物结构；通过系统发育分析推断酶的进化起源。
核心内容
研究从向日葵线性腺毛中克隆并功能鉴定了两个双没药烯合酶基因HaTPS12_K7和HaTPS12_K11。以拟南芥（Z）-γ-双没药烯合酶为查询序列，通过EST数据库搜索和cDNA扩增获得全长开放阅读框，两者均为1698 bp，编码565个氨基酸，仅存在5个氨基酸差异。在工程酵母EPY300中异源表达后，经GC-MS和2D NMR鉴定，两种酶均催化FPP生成（Z）-γ-双没药烯，其中K7产量为33 mg/L，K11为12 mg/L。通过N端融合硫氧还蛋白，产量分别提升5倍至166 mg/L和3.5倍至42 mg/L。系统发育分析表明，这两种酶与菊科β-法尼烯合酶聚为一支，而与拟南芥的对应酶不在同一分支，提示其可能由β-法尼烯合酶经微小氨基酸替换演化而来，属趋同进化。该工作首次鉴定了菊科植物线性腺毛中双没药烯型倍半萜生物合成的关键酶，为理解该特殊分泌结构中萜类代谢的进化起源提供了酶学证据，同时也为微生物高产双没药烯的代谢工程改造提供了有效的酶元件。
创新点
首次从菊科植物向日葵的线性腺毛中克隆并功能表征了两个（Z）-γ-双没药烯合酶HaTPS12_K7和HaTPS12_K11；利用N端硫氧还蛋白融合显著提高了酵母中的产量（K7提高5倍至166 mg/L）；系统发育分析表明这两个酶与β-法尼烯合酶具有高度相似性，可能由其微小突变演化而来，而与拟南芥的（Z）-γ-双没药烯合酶为趋同进化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EPY300 | 甲羟戊酸途径（内源FPP合成） | — | — | 能量供给 | 工程酵母菌株，通过高表达FPP为双没药烯合酶提供前体 |
| Saccharomyces cerevisiae EPY300 | 倍半萜生物合成（FPP→γ-双没药烯） | HaTPS12_K7 | (Z)-γ-bisabolene synthase | 催化 | 全长1698 bp，编码565 aa，分子量66.49 kDa，产物为(Z)-γ-bisabolene |
| Saccharomyces cerevisiae EPY300 | 倍半萜生物合成（FPP→γ-双没药烯） | HaTPS12_K11 | (Z)-γ-bisabolene synthase | 催化 | 全长1698 bp，编码565 aa，分子量66.53 kDa，与K7有5个氨基酸差异，产量较低 |
关键发现
- 从向日葵LGT中克隆到两个双没药烯合酶基因HaTPS12_K7和HaTPS12_K11，全长均为1698 bp，编码565个氨基酸，分子量分别为66.49 kDa和66.53 kDa，两者有5个氨基酸差异。在工程酵母EPY300中异源表达后，HaTPS12_K7产量为33 mg/L，HaTPS12_K11为12 mg/L
- N端融合硫氧还蛋白后，产量分别提高5倍至166 mg/L和3.5倍至42 mg/L。经GC-MS和2D NMR鉴定，两种酶的产物均为（Z）-γ-双没药烯。系统发育分析显示，这两个酶与菊科的β-法尼烯合酶、α-双没药醇合酶等聚为一支，而与拟南芥的（Z）-γ-双没药烯合酶不在同一分支。
研究结论
向日葵LGT中的HaTPS12_K7和HaTPS12_K11编码两个功能性的（Z）-γ-双没药烯合酶，可能参与这些毛状体中双没药烯型倍半萜的生物合成；它们很可能由β-法尼烯合酶经过微小氨基酸替换演变而来。