Identification and characterization of L-lysine decarboxylase from Huperzia serrata and its role in the metabolic pathway of lycopodium alkaloid
- 作者
- Baofu Xu, Lei Lei, Xiaocen Zhu, Yiqing Zhou, Youli Xiao
- 单位
- CAS Key Laboratory of Synthetic Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences; CAS-JIC Centre of Excellence in Plant and Microbial Sciences
- 杂志
- Phytochemistry（2017）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2016.12.022
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
石杉碱甲（Huperzine A）生物合成途径中第一步赖氨酸脱羧酶（LDC）的鉴定与功能表征，以及第二步反应的产物检测方法缺乏直接证据。
研究策略
通过简并PCR和RACE从蛇足石杉中克隆LDC基因，在大肠杆菌中异源表达纯化并进行酶动力学表征；通过烟草瞬时表达验证体内功能；开发衍生化方法同时检测赖氨酸脱羧产物尸胺和铜胺氧化酶产物5-氨基戊醛。
核心内容
本研究从蛇足石杉中克隆获得6个赖氨酸脱羧酶cDNA，并对其中的HsLDC进行了系统的功能表征。通过在大肠杆菌中异源表达纯化，测得HsLDC对L-赖氨酸的Km为0.878 mM，kcat为1.85 s⁻¹，催化效率kcat/Km达2.11 s⁻¹ mM⁻¹，为已报道植物LDC中的最高值。通过LC-MS/MS鉴定PLP结合位点为K118，该位点突变后酶活性下降约90%。在烟草中瞬时表达HsLDC使尸胺含量从零提升至0.75 mg/g干重，约为腐胺含量的5倍。研究还开发了同时检测尸胺和5-氨基戊醛的衍生化方法，并证实HsLDC与铜胺氧化酶HsCAO共表达时尸胺含量下降约90%且可检测到5-氨基戊醛。该工作为石杉碱甲生物合成途径前两步（赖氨酸脱羧生成尸胺、尸胺氧化脱氨生成5-氨基戊醛）提供了直接的体内外证据，为后续完整途径解析及异源生产石杉碱甲奠定了基础。
创新点
首次从蛇足石杉中克隆并功能表征了具有已报道植物LDC中最高催化效率的赖氨酸脱羧酶；开发了同时检测尸胺和5-氨基戊醛的方便可靠的方法；提供了石杉碱甲生物合成前两步的直接体内外证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 赖氨酸脱羧途径 | HsLDC | L-赖氨酸脱羧酶 | 催化 | 用于异源表达和纯化，进行体外酶动力学表征 |
| Nicotiana benthamiana | 石杉碱甲生物合成途径 | HsLDC | L-赖氨酸脱羧酶 | 催化 | 瞬时表达后尸胺含量从0升至0.75 mg/g干重 |
| Nicotiana benthamiana | 石杉碱甲生物合成途径 | HsCAO | 铜胺氧化酶 | 催化 | 与HsLDC共表达将尸胺转化为5-氨基戊醛，使尸胺含量下降约90% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 赖氨酸脱羧途径 | HsLDC-K118A | L-赖氨酸脱羧酶突变体 | 催化 | PLP结合位点突变，活性较野生型降低约90% |
关键发现
- 从蛇足石杉克隆到6个LDC cDNA，其中HsLDC被功能表征。HsLDC对L-赖氨酸的Km为0.878 mM，kcat为1.85 s^-1，kcat/Km为2.11 s^-1 mM^-1，为已报道植物LDC中最高
- 对L-鸟氨酸的kcat/Km为1.94 s^-1 mM^-1。PLP结合位点K118通过LC-MS/MS鉴定，突变体HsLDC-K118A活性降低约90%。在烟草中瞬时表达HsLDC使尸胺含量从0增加到0.75 mg/g干重，且尸胺含量约为腐胺的5倍。与HsCAO共表达后，尸胺含量下降约90%，并检测到5-氨基戊醛。体外一锅反应中HsLDC与HsCAO联用时，尸胺积累多于5-氨基戊醛。
研究结论
本研究提供了石杉碱甲生物合成途径中前两步（赖氨酸脱羧生成尸胺，尸胺氧化脱氨生成5-氨基戊醛）的直接证据，为后续途径解析及利用合成生物学异源生产石杉碱甲奠定了重要基础。