高级醇 · 代谢工程文献库

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Identification of iridoid synthases from Nepeta species: Iridoid cyclization does not determine nepetalactone stereochemistry

作者
Nathaniel H. Sherden, Benjamin Lichman, Lorenzo Caputi, Dongyan Zhao, Mohamed O. Kamileen, C. Robin Buell, Sarah E. O'Connor
单位
Department of Biological Chemistry, The John Innes Centre, Norwich, NR4 7UH, UK; Department of Plant Biology, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA
杂志
Phytochemistry（2018）
DOI
10.1016/j.phytochem.2017.10.004
所属领域
天然产物生物合成
关键词
IridoidNatural product biosynthesisShort chain alcohol dehydrogenaseTerpenoid
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解决的核心问题

Nepeta属植物中nepetalactone生物合成相关基因尚未鉴定，iridoid synthase是否决定nepetalactone不同立体异构体的生成尚不明确。

研究策略

对产生不同nepetalactone立体异构体谱的N. cataria和N. mussinii进行转录组测序，通过同源搜索鉴定iridoid synthase候选基因，在大肠杆菌中异源表达并进行体外酶活与动力学分析。

研究路线图

100%
核心问题：Nepeta属nepetalactone合成基因未鉴定，立体异构体生成机制不清
策略：两种Nepeta转录组测序+同源搜索+大肠杆菌异源表达+体外酶活分析
克隆NcISY1/2、NmISY1/2、CrISY，构建5个大肠杆菌异源表达体系
体外酶活测定：8-oxogeranial + NADPH 反应；NmISY2动力学参数解析
转录组结果：N. cataria 77,879条转录本；N. mussinii 69,775条；N50分别为1490/1589 bp
序列分析：ISY家族1同源性98%、家族2同源性99%；与CrISY一致性53-58%；家族2酶活显著高于家族1
产物谱：NcISY2/NmISY2均以cis-trans-iridodial为主；与CrISY几乎一致；ISY环化不决定4α/7α立体化学
结论：nepetalactone立体化学下游酶决定；本研究提供生物合成通路起点与转录组资源
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核心内容

本研究对两种积累不同nepetalactone立体异构体的荆芥属植物Nepeta cataria（主要积累cis-trans型）和N. mussinii（主要积累trans-cis型）进行转录组测序，通过同源搜索鉴定并首次表征了四个iridoid synthase（ISY）候选基因。系统发育分析显示两种植物各含family1和family2两个亚家族，其中family2酶活性显著高于family1；以NmISY2为代表进行动力学表征，其对8-oxogeranial的Km为7.3±0.7 μM，kcat为0.60±0.02 s⁻¹。体外产物谱分析表明，NcISY2和NmISY2的环化产物与长春花CrISY几乎一致，均以cis-trans-iridodial为主，仅产生少量trans-cis异构体。值得注意的是，family2活性位点存在赖氨酸被苯丙氨酸替换及Gly150Ala突变，但催化功能仍保守。由于两种植物的ISY均产生相似的环化产物谱，而其nepetalactone立体化学表型截然不同，该结果明确证明iridoid synthase的环化步骤不决定4α和7α位立体化学，立体化学差异应由下游异构化或差向异构化酶控制。该工作为解析荆芥属nepetalactone完整生物合成通路提供了关键起点和转录组资源。

创新点

首次鉴定并表征Nepeta属的iridoid synthase；发现其活性位点存在异常突变但催化功能保守；通过体外产物谱证明ISY环化不决定4α和7α立体化学，提示立体化学由下游酶控制。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli (heterologous expression) Iridoid/nepetalactone biosynthesis NcISY1 iridoid synthase 1 from Nepeta cataria (NcISY1) 催化 属于短链脱氢酶SDR75U家族；端点法显示活性极低，产物主要为cis-trans-nepetalactol和iridodials
Escherichia coli (heterologous expression) Iridoid/nepetalactone biosynthesis NcISY2 iridoid synthase 2 from Nepeta cataria (NcISY2) 催化 高活性；产物谱与C. roseus ISY一致；活性位点Lys→Phe，Gly→Ala突变
Escherichia coli (heterologous expression) Iridoid/nepetalactone biosynthesis NmISY1 iridoid synthase 1 from Nepeta mussinii (NmISY1) 催化 活性极低，几乎无生理相关性
Escherichia coli (heterologous expression) Iridoid/nepetalactone biosynthesis NmISY2 iridoid synthase 2 from Nepeta mussinii (NmISY2) 催化 高活性；动力学参数已测定；产物谱与C. roseus ISY一致；活性位点Lys→Phe，Gly→Ala突变
Escherichia coli (heterologous expression) Iridoid/nepetalactone biosynthesis CrISY iridoid synthase from Catharanthus roseus 催化 作为阳性对照，产物谱与Nepeta ISY family2相似

关键发现

  1. N. cataria主要积累cis-trans-nepetalactone，N. mussinii主要积累trans-cis-nepetalactone
  2. 两种Nepeta各含两个ISY同源基因（family1和family2），family1氨基酸序列一致性80%（NcISY1/NcISY2）和79%（NmISY1/NmISY2），两种植物间family1同源性98%，family2同源性99%，与C. roseus ISY一致性53-58%
  3. family2酶活性显著高于family1
  4. NmISY2动力学参数：8-oxogeranial Km=7.3±0.7 μM，kcat=0.60±0.02 s^-1
  5. NADPH Km=26.2±5.1 μM，kcat=0.84±0.06 s^-1
  6. NcISY2和NmISY2产物谱与C. roseus ISY几乎一致，均以cis-trans产物为主并产生少量trans-cis-iridodial
  7. family2中活性位点Lys被Phe替换，Gly150突变为Ala
  8. 转录组数据N. cataria 77,879条转录本，N50 1490 bp
  9. N. mussinii 69,775条，N50 1589 bp。

研究结论

Nepeta中iridoid synthase的环化产物不区分物种的立体化学表型，因此nepetalactone在4α和7α位的立体化学差异不是由ISY环化决定，而是由下游异构化/差向异构化酶决定。该研究为Nepeta中nepetalactone生物合成通路提供了起点和转录组资源。