Cytochrome P450s from Cynara cardunculus L. CYP71AV9 and CYP71BL5, catalyze distinct hydroxylations in the sesquiterpene lactone biosynthetic pathway
- 作者
- Kaouthar Eljounaidi, Katarina Cankar, Cinzia Comino, Andrea Moglia, Alain Hehn, Frédéric Bourgaud, Harro Bouwmeester, Barbara Menin, Sergio Lanteri, Jules Beekwilder
- 单位
- Dipartimento di Scienze Agrarie, Forestali e Alimentari, University of Torino; Plant Research International; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University; Université de Lorraine, UMR 1121 Agronomie et Environnement; INRA, UMR 1121 Agronomie et Environnement; PTP/Rice Genomics Unit
- 杂志
- Plant Science（2014）
- DOI
- 10.1016/j.plantsci.2014.03.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明洋蓟（Cynara cardunculus）中倍半萜内酯（STL）生物合成途径中两个细胞色素P450酶（GAO和COS）的功能，并解析由germacrene A到costunolide的氧化步骤。
研究策略
以菊苣中已知GAO和COS序列为探针，从C. cardunculus的约19,000条unigene数据库中筛选同源基因，克隆得到CcGAO和CcCOS；在酵母和本氏烟草中异源表达，借助GC-MS和LC-MS代谢谱分析进行功能表征；并通过与不同萜烯合酶共表达测试CcGAO的底物特异性。
核心内容
该研究从洋蓟（Cynara cardunculus）约19,000条unigene数据库中克隆并功能表征了两个细胞色素P450酶CYP71AV9（CcGAO）和CYP71BL5（CcCOS），分别编码486和494个氨基酸。通过酵母和本氏烟草异源表达及GC-MS、LC-MS代谢谱分析，证实CcGAO催化germacrene A的C12位连续氧化生成germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid，而CcCOS则催化后续羟基化反应形成(+)-costunolide。在烟草中共表达CcGAS、CcGAO和CcCOS时检测到costunolide与半胱氨酸（m/z 354.14）及谷胱甘肽（m/z 540.21）的偶联物，表明该通路可完整重构，且胞质定位的CcGAS产量比叶绿体定位平均高3倍。此外，CcGAO表现出宽底物特异性，能氧化amorpha-4,11-diene生成青蒿酸等产物。该工作阐明了洋蓟倍半萜内酯生物合成中的关键氧化步骤，为利用微生物或植物平台生产此类药用次生代谢物提供了基因资源。
创新点
首次克隆并功能表征了Cynara cardunculus中的CYP71AV9（germacrene A oxidase）和CYP71BL5（costunolide synthase）；证明CYP71AV9具有宽底物特异性，可氧化amorpha-4,11-diene、(+)-germacrene D和cascarilladiene等非天然底物。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 倍半萜内酯生物合成 | CYP71AV9 (CcGAO) | CYP71AV9 (germacrene A oxidase) | 催化 | 氧化germacrene A的C12甲基，生成germacrene A酸 |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 倍半萜内酯生物合成 | CYP71BL5 (CcCOS) | CYP71BL5 (costunolide synthase) | 催化 | 催化germacrene A酸羟基化，经自发内酯化生成costunolide |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 倍半萜内酯生物合成 | CiGAS (Cichorium intybus germacrene A synthase) | germacrene A synthase | 催化 | 将FPP环化为germacrene A |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 倍半萜内酯生物合成 | TpGAS (Tanacetum parthenium germacrene A synthase) | germacrene A synthase | 催化 | 与CiGAO、CcCOS共表达用于costunolide合成 |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 倍半萜内酯生物合成 | CiGAO (Cichorium intybus germacrene A oxidase) | germacrene A oxidase | 催化 | 与TpGAS、CcCOS共表达产生costunolide |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 萜类代谢 | AaAMDS (Artemisia annua amorpha-4,11-diene synthase) | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 用于测试CcGAO底物特异性，生成amorpha-4,11-diene |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 萜类代谢 | ScGDS (Solidago canadensis (+)-germacrene D synthase) | (+)-germacrene D synthase | 催化 | 用于测试CcGAO底物特异性，生成(+)-germacrene D |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 萜类代谢 | ScCS (Solidago canadensis cascarilladiene synthase) | cascarilladiene synthase | 催化 | 用于测试CcGAO底物特异性，生成cascarilladiene |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜内酯生物合成 | CcGAS (Cynara cardunculus germacrene A synthase) | germacrene A synthase | 催化 | 在本氏烟草中异源表达，胞质定位产量比叶绿体/线粒体定位高3倍 |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜内酯生物合成 | CcGAO (CYP71AV9) | CYP71AV9 (germacrene A oxidase) | 催化 | 与CcGAS共表达时使germacrene A转化，但产物未在顶空或二氯甲烷提取物中检测到 |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜内酯生物合成 | CcCOS (CYP71BL5) | CYP71BL5 (costunolide synthase) | 催化 | 与CcGAS、CcGAO共表达产生costunolide-半胱氨酸和costunolide-谷胱甘肽偶联物 |
关键发现
- 从C. cardunculus中克隆到CcGAO（CYP71AV9，ORF 1461 bp，编码486个氨基酸）和CcCOS（CYP71BL5，ORF 1485 bp，编码494个氨基酸）；CcGAO与Saussurea costus GAO有95%氨基酸同源性，与Lactuca sativa GAO有89%同源性，CcCOS与Cichorium intybus和Lactuca sativa COS均有88%同源性；在酵母中共表达CcGAO与CiGAS，在缓冲条件下生成germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid（m/z 234，保留时间17.41 min），在酸性条件下生成germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-ol和germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-al；共表达CcCOS、TpGAS和CiGAO在酵母中产生(+)-costunolide（LC-MS保留时间39.21 min）；在本氏烟草中共表达CcGAS、CcGAO和CcCOS产生costunolide-半胱氨酸偶联物（m/z
- 14，保留时间22.16 min）和costunolide-谷胱甘肽偶联物（m/z
- 21，保留时间22.50 min）；胞质定位的CcGAS比叶绿体/线粒体定位的产量平均高3倍；CcGAO可氧化amorpha-4,11-diene生成artemisinic alcohol、artemisinic acid和dihydroartemisinic aldehyde，氧化(+)-germacrene D生成三种氧化产物（m/z 220和222），氧化cascarilladiene生成一种氧化产物（m/z 220）。
研究结论
CYP71AV9和CYP71BL5分别催化germacrene A的C12位连续氧化和costunolide形成中的羟基化反应，是洋蓟倍半萜内酯生物合成通路中的关键酶；该研究为利用微生物或植物平台生产此类药用次生代谢物提供了基因资源和理论基础。