Precursor feeding studies and molecular characterization of GERANIOL SYNTHASE establish the limiting role of geraniol in monoterpene indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus leaves
- 作者
- Krishna Kumar, Sarma Rajeev Kumar, Varun Dwivedi, Avanish Rai, Ashutosh K. Shukla, Karuna Shanker, Dinesh A. Nagegowda
- 单位
- CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants Research Centre, Bengaluru - 560065, India; Biotechnology Division, CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, P.O. CIMAP, Lucknow - 226015, India; Analytical Chemistry Department, CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, P.O. CIMAP, Lucknow - 226015, India
- 杂志
- Plant Science（2015）
- DOI
- 10.1016/j.plantsci.2015.07.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在长春花（Catharanthus roseus）叶片中，单萜吲哚生物碱（MIA）的合成究竟受萜烯部分（geraniol）还是吲哚部分（tryptophan）前体的限制，此前缺乏叶片组织中的证据。
研究策略
通过前体（geraniol、nerol、tryptophan）饲喂试验，结合CrGES的时空表达分析、病毒诱导基因沉默（VIGS）、瞬时过表达、生化回补以及不同品种间表达与MIA含量的相关性分析，系统验证geraniol在MIA生物合成中的限制作用。
核心内容
本研究以长春花叶片为对象，系统探究单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成的限制性前体。通过前体饲喂试验发现，0.5 mM香叶醇处理可使叶片中catharanthine和vindoline含量提高约2.2倍，而色氨酸饲喂无明显效果，表明萜烯部分而非吲哚部分是MIA合成的限制因素。研究者进一步对香叶醇合酶基因CrGES进行了分子表征：该基因在叶片和茎中表达最高，受200 μM茉莉酸甲酯诱导，处理8小时表达上调约5倍。病毒诱导基因沉默CrGES使转录水平下降约80%，catharanthine、vindoline和vinblastine含量分别降低约49%、57%和60%，而外源补充香叶醇可恢复MIA含量至对照水平；瞬时过表达CrGES则使catharanthine和vindoline分别增加约3倍和2.8倍。表达相关性分析显示，高MIA品种中CrGES表达量比低MIA品种高3倍以上，且CrGES表达水平显著低于MEP途径及下游各基因。这些结果表明CrGES催化的香叶醇供应是MIA生物合成的关键限速环节，为通过上调CrGES进行代谢工程改造以提高MIA产量提供了明确靶点。
创新点
首次在长春花叶片中证明geraniol而非tryptophan是MIA生物合成的限制前体；通过VIGS和过表达为CrGES在MIA合成中的体内功能提供了遗传学证据；发现CrGES表达水平显著低于其上下游通路基因，揭示了geraniol供应对MIA通量的关键调控作用。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | CrGES | 香叶醇合酶 (geraniol synthase) | 催化 | 催化GPP转化为geraniol，是裂环马钱素生物合成的第一步 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | G8O | 香叶醇-10-羟化酶/8-氧化酶 | 催化 | 催化geraniol羟基化，下游基因，其表达不受CrGES沉默影响 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺，吲哚途径关键酶 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | STR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化secologanin与色胺缩合生成异胡豆苷 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | ORCA3 | octadecanoid-responsive Catharanthus AP2/ERF蛋白3 | 调控 | MIA途径关键转录因子，受MeJA诱导 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | MYC2 | bHLH转录因子MYC2 | 调控 | 调控MIA途径基因表达 |
| Catharanthus roseus叶片 | MEP途径（类异戊二烯前体） | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个限速酶，表达量远高于CrGES |
| Catharanthus roseus叶片 | MEP途径（类异戊二烯前体） | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径关键酶 |
| Catharanthus roseus叶片 | MEP途径（类异戊二烯前体） | MECS | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Catharanthus roseus叶片 | MEP途径（类异戊二烯前体） | HDS | (E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 | 催化 | MEP途径末端酶 |
| Catharanthus roseus叶片 | 单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 作为VIGS实验的视觉标记，沉默后产生光漂白现象 |
关键发现
- 5 mM geraniol饲喂使长春花叶片中catharanthine和vindoline含量增加约2.2倍，而tryptophan饲喂无明显效果
- CrGES在叶片和茎中表达最高，受200 μM MeJA诱导，处理8小时表达达峰值（约5倍上调）
- VIGS沉默CrGES使转录水平下降约80%，catharanthine、vindoline和vinblastine含量分别降低约49%、57%和60%
- 对CrGES沉默叶片饲喂0.5 mM geraniol可恢复MIA含量至接近空载体对照水平
- 瞬时过表达CrGES使catharanthine和vindoline含量分别增加约3倍和2.8倍
- 高MIA品种cv. Dhawal中CrGES表达量比低MIA品种cv. Nirmal高>3倍，且catharanthine和vindoline含量也高>3倍
- CrGES表达量比MEP途径基因（DXS、DXR、MECS、HDS）低1.5–27倍，比secoiridoid和indole通路基因（G8O、TDC）低15–43倍，比MIA下游基因（STR、SGD、D4H）及转录因子（ORCA3、MYC2）低约25–40倍。
研究结论
长春花叶片中geraniol（由CrGES催化生成）的供应是MIA生物合成的关键限制因素；CrGES的转录调控及其产物geraniol的有效性控制着流向裂环马钱素（secologanin）途径及MIA的代谢通量。未来代谢工程改造应重点考虑上调CrGES表达以提高MIA产量。