Nerolidol production in agroinfiltrated tobacco: impact of protein stability and membrane targeting of strawberry (Fragraria ananassa) NEROLIDOL SYNTHASE1
- 作者
- Paola Andrade, David Manzano, Karla Ramirez-Estrada, Daniel Caudepon, Montserrat Arro, Albert Ferrer, Michael A. Phillips
- 单位
- Center for Research in Agricultural Genomics (CRAG) (CSIC-IRTA-UAB-UB), Campus UAB, Bellaterra, Barcelona, Spain; Department of Biochemistry and Physiology, Faculty of Pharmacy and Food Sciences, University of Barcelona, Barcelona, Spain; Department of Biology, University of Toronto – Mississauga, Mississauga, Ontario, L5L 1C6 Canada; Department of Cellular and Systems Biology, University of Toronto, Toronto, Ontario M5S 3G5, Canada
- 杂志
- Plant Science（2017）
- DOI
- 10.1016/j.plantsci.2017.11.013
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过内质网靶向和蛋白稳定性优化，提高草莓法尼基/橙花叔醇合酶（FaNES1）在本氏烟中异源合成橙花叔醇的产量。
研究策略
利用农杆菌浸润在本氏烟叶片中瞬时表达FaNES1融合蛋白：分别融合内质网跨膜域（HMGR1S或SQS）锚定到内质网，或融合GFP作为可溶性蛋白；通过共聚焦显微镜和膜分级验证定位，用绝对定量RT-PCR检测转录水平，Western blot检测蛋白积累，并建立SPME-GCMS定量橙花叔醇，同时用LCMS/MS检测非挥发性结合物。
核心内容
本研究利用农杆菌浸润在本氏烟叶片中瞬时表达草莓法尼基/橙花叔醇合酶FaNES1的不同融合形式，比较内质网靶向与可溶性表达对橙花叔醇产量的影响。作者分别将FaNES1融合拟南芥HMGR1S或SQS跨膜域锚定至内质网膜，或融合GFP作为可溶性蛋白，通过共聚焦显微镜和膜分级确认定位，结合绝对定量RT-PCR、Western blot和SPME-GCMS分析产量。结果显示，ER锚定形式的转录水平较游离FaNES1提高约4至7倍，蛋白积累也显著高于可溶性形式，但FaNES1-GFP融合蛋白积累量最高，对应橙花叔醇产量最高约3.0 μg/g鲜重，ER靶向形式次之，产量范围为0.5至2.5 μg/g鲜重。建立的SPME-GCMS法检出限1.54 pg、定量限5.13 pg，内标回收率仅3%至4%，提示实际产量可能更高。产量按蛋白量归一化后，ER靶向与GFP融合无显著差异，表明内质网FDP富集微环境可支持倍半萜合成，但提高蛋白稳定性（如融合GFP）是实现高产的更直接有效策略，蛋白积累水平比转录水平更能预测终产产量。
创新点
首次将FaNES1靶向内质网膜用于橙花叔醇代谢工程；建立了适用于新鲜冷冻烟草组织的静态顶空SPME-GCMS定量方法；发现蛋白积累水平而非转录水平是预测橙花叔醇产量的更可靠指标。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | 倍半萜生物合成/MVA途径 | FaNES1 (AX528996) | FaNES1（草莓芳樟醇/橙花叔醇合酶） | 催化 | 以FDP为底物生成橙花叔醇，也可利用GDP生成芳樟醇；在胞质可溶形式和ER锚定形式中均有活性。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | 倍半萜生物合成 | HMGR1S（拟南芥）跨膜域编码序列 | HMGR1S跨膜域 | 区室化 | 将FaNES1通过N端融合锚定到内质网外膜，提高蛋白稳定性。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | 倍半萜生物合成 | SQS1（拟南芥）跨膜域编码序列 | SQS1跨膜域 | 区室化 | 将FaNES1通过C端融合锚定到内质网外膜，提高蛋白稳定性。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | 萜类前体供应 | GFP（绿色荧光蛋白基因） | GFP（融合标签） | 调控 | 作为溶解度增强标签，FaNES1-GFP融合蛋白积累量最高，橙花叔醇产量最高。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | MVA途径/萜类前体供应 | FPS1/FPS2（内源） | 法尼基焦磷酸合酶（FPS） | 催化 | 内源FPS催化IDP和DMADP缩合生成FDP，为橙花叔醇合成提供底物。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | MVA途径 | HMGR（内源） | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | MVA途径限速酶，定位于ER；其跨膜域被用作ER锚定标签。 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟） | 甾醇/萜类合成 | SQS（内源） | 角鲨烯合酶（SQS） | 催化 | 内源SQS与FaNES1竞争FDP，其跨膜域被用作ER锚定标签。 |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105（用于递送） | 无 | HCPro | HCPro（helper component proteinase） | 调控 | 共浸润的RNA沉默抑制因子，提高瞬时表达效率。 |
关键发现
- 将FaNES1融合到HMGR1S或SQS跨膜域可成功定位到内质网，融合HMGR1S的FaNES1转录水平比FaNES1 alone提高约7倍，融合SQS或GFP的转录水平提高约4倍
- ER锚定形式蛋白积累显著高于可溶性形式，但FaNES1-GFP融合蛋白积累量最高。SPME-GCMS法的检出限为1.54 pg，定量限为5.13 pg。橙花叔醇产量范围为0.5-3.0 μg/g鲜重，其中FaNES1-GFP产量最高，ER靶向次之。内标香叶醇回收率仅3-4%，实际产量可能更高。当产量按蛋白量归一化时，ER靶向与GFP融合形式无显著差异（p=0.12和0.08）。另检测到羟基橙花叔醇-丙二酰-酮戊糖苷等非挥发性结合物，其积累模式与游离橙花叔醇一致。
研究结论
内质网膜是FDP富集的微环境，可作为倍半萜代谢工程的可行靶点；蛋白积累水平是橙花叔醇产量的更好预测指标；融合GFP提高蛋白稳定性是实现最高产量的有效策略。