Additional diterpenes from Physcomitrella patens synthesized by copalyl diphosphate/kaurene synthase (PpCPS/KS)
- 作者
- Xin Zhan, Søren Spanner Bach, Nikolaj Lervad Hansen, Christina Lunde, Henrik Toft Simonsen
- 单位
- Plant Biochemistry Laboratory, Copenhagen Plant Science Centre, Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen, Thorvaldsensvej 40, DK-1871 Frederiksberg, Denmark
- 杂志
- Plant Physiology and Biochemistry（2015）
- DOI
- 10.1016/j.plaphy.2015.07.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示苔藓植物Physcomitrella patens中双功能二萜合酶PpCPS/KS除已知产物外还能合成哪些新的二萜化合物，并确认这些产物在植物体内的来源。
研究策略
构建PpCPS/KS基因敲除突变体，结合异源表达（本氏烟草瞬时表达和大肠杆菌表达），利用GC-MS分析和顶空固相微萃取（HS-SPME）及正己烷提取两种方法对比检测野生型与突变体的二萜产物谱。
核心内容
该研究通过基因敲除与异源表达策略，系统揭示了苔藓植物小立碗藓中双功能二萜合酶PpCPS/KS的产物多样性。研究构建了PpCPS/KS基因敲除突变体，并结合本氏烟草瞬时表达与大肠杆菌表达系统，利用GC-MS结合顶空固相微萃取和正己烷提取两种方法对比分析产物谱。结果确认该酶在体内外均能催化牻牛儿基牻牛儿基二磷酸生成ent-beyerene、ent-sandaracopimaradiene、ent-kaur-16-ene及16-hydroxy-ent-kaurene至少四种二萜产物，敲除后这些化合物全部消失。其中ent-beyerene和ent-sandaracopimaradiene为首次报道的新产物，且仅在顶空固相微萃取中检出，而16-hydroxy-ent-kaurene仅在正己烷提取中检出，提示不同产物挥发性和提取效率存在差异。储存过程中16-hydroxy-ent-kaurene可转化为ent-kaur-15-ene，因此后者是否为直接酶产物尚待确认。该工作表明PpCPS/KS是一个典型的多产物酶，其产物谱的丰富性为理解植物二萜合酶早期进化及碳正离子催化机制提供了关键实验证据。
创新点
首次报道PpCPS/KS在体内和异源宿主中还能催化生成ent-beyerene和ent-sandaracopimaradiene等新二萜产物；通过基因敲除确认这些产物均为PpCPS/KS的酶促产物；证明该酶是多产物酶，为理解植物二萜合酶进化提供了新证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Physcomitrella patens | 二萜生物合成（GGPP衍生物） | PpCPS/KS | PpCPS/KS | 催化 | 双功能二萜合酶，催化GGPP环化生成ent-beyerene等；本研究通过基因敲除验证其体内功能 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | PpCPS/KS | PpCPS/KS | 催化 | 瞬时表达确认产物谱 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | PpCPS/KS | PpCPS/KS | 催化 | 与Abies grandis GGPPS共表达，异源表达验证产物 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | FfCPS/KS | FfCPS/KS | 催化 | 来自Fusarium fujikuroi的CPS/KS，作为对照酶验证化合物鉴定 |
关键发现
PpCPS/KS在体内（P. patens）和异源系统（N. benthamiana及E. coli）中均催化产生ent-beyerene (1)、ent-sandaracopimaradiene (2)、ent-kaur-16-ene (4)和16-hydroxy-ent-kaurene (5)，可能还有ent-kaur-15-ene (3)。其HP5柱科瓦茨保留指数分别为1:1944、2:1960、3:2009、4:2057。PpCPS/KS敲除后这些二萜全部消失。1和2仅在HS-SPME中检出，5仅在正己烷提取中检出，4和3两种方法均可检测。储存过程中16-hydroxy-ent-kaurene (5)会转化为ent-kaur-15-ene (3)，因此3是否为直接酶产物尚未最终确认。
研究结论
PpCPS/KS是一个多产物酶，从共同前体牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGPP）催化合成至少四种（可能五种）二萜化合物。该酶作为植物中进化早期出现的二萜合酶，可能为后来植物二萜合酶的多样化提供了多产物平台，其催化机制支持了关于碳正离子中间体（如C13仲碳正离子）的理论计算。