Molecular cloning and functional analysis of a 10-epi-junelon synthase from Inula hupehensis
- 作者
- Jun-Bo Gou, Zhen-Qiu Li, Chang-Fu Li, Fang-Fang Chen, Shi-You Lv, Yan-Sheng Zhang
- 单位
- CAS Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences; Graduate University of Chinese Academy of Sciences; College of Life Sciences, Hebei University
- 杂志
- Plant Physiology and Biochemistry（2016）
- DOI
- 10.1016/j.plaphy.2016.05.023
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
倍半萜内酯类化合物（如eudesmanolide）的生物合成关键酶基因未知，尤其是10-epi-junenol合酶基因从未被分离克隆，其生物合成途径缺乏分子证据。
研究策略
基于已知萜类合酶保守序列设计简并引物，从湖北旋覆花（Inula hupehensis）幼叶cDNA中通过RT-PCR和RACE技术克隆候选合酶基因IhsTPS1；利用大肠杆菌异源表达、亲和纯化获得重组蛋白，以法尼基焦磷酸（FPP）为底物进行体外酶促反应，通过GC-MS鉴定产物，并结合荧光定量PCR和植物组织代谢物含量分析验证其在体内的功能。
核心内容
该研究首次从湖北旋覆花中克隆并功能鉴定了10-epi-junenol合酶基因IhsTPS1。研究者基于萜类合酶保守序列设计简并引物，通过RT-PCR和RACE技术从幼叶cDNA中获得该基因，其开放阅读框编码529个氨基酸，与菊苣germacrene A合酶一致性达61%。将IhsTPS1在大肠杆菌中异源表达并纯化后，以法尼基焦磷酸（FPP）为底物进行体外酶促反应，GC-MS分析显示其主要产物为10-epi-junenol（占57.69%），其次为τ-cadinol（占26.99%），两种异构体保留指数分别为1581和1617，证实该酶直接催化FPP环化生成10-epi-junenol，无需前体氧化步骤。荧光定量PCR和组织代谢物分析表明，IhsTPS1转录水平与10-epi-junenol积累模式一致，均在幼叶中最高，根和花中较低，茎中未检测到。该工作首次从分子水平揭示了10-epi-junenol的直接生物合成机制，为后续利用代谢工程或合成生物学手段提高其产量提供了关键酶基因基础。
创新点
['首次从植物中克隆得到编码10-epi-junenol合酶的cDNA（IhsTPS1）', '证实IhsTPS1直接催化FPP生成10-epi-junenol，而非经过前体氧化步骤', '揭示了10-epi-junenol合酶在体内的表达模式与产物积累的相关性']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | IhsTPS1 | IhsTPS1 (10-epi-junenol synthase) | 催化 | 异源表达重组IhsTPS1，以FPP为底物催化生成10-epi-junenol等倍半萜化合物 |
| Inula hupehensis | 倍半萜内酯（eudesmanolide）生物合成 | IhsTPS1 | IhsTPS1 | 催化 | 体内表达水平与10-epi-junenol积累模式一致，参与植物体内10-epi-junenol的合成 |
关键发现
- ['克隆得到IhsTPS1基因，其ORF编码529个氨基酸，与菊苣germacrene A合酶（CiGAS）氨基酸一致性达61%', '体外酶活实验表明IhsTPS1可将FPP转化为多种倍半萜，其中10-epi-junenol为主要产物（占57.69%），τ-cadinol为第二大产物（占26.99%）', '产物10-epi-junenol的保留指数（RI）为1581，其异构体junenol的RI为1617，二者显著不同', 'IhsTPS1转录水平在幼叶中最高，根和花中较低，茎中无表达
- 10-epi-junenol积累模式与转录水平一致', '10-epi-junenol在幼叶中含量最高，其次为根和花，茎中未检测到']
研究结论
IhsTPS1是湖北旋覆花中催化FPP直接环化生成10-epi-junenol的关键酶，首次从分子水平阐明了10-epi-junenol的生物合成机制，为通过代谢工程或合成生物学提高10-epi-junenol产量奠定了基础。