高级醇 · 代谢工程文献库

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Linalool and linalool nerolidol synthases in roses, several genes for little scent.

作者
Jean-Louis Magnard, Aurélie Rius Bony, Fabienne Bettini, Ausilia Campanaro, Bernard Blerot, Sylvie Baudino, Frédéric Jullien
单位
Univ Lyon, UJM-Saint-Etienne, CNRS, BVpam FRE 3727, F-42023, SAINT-ETIENNE, France; International Flavors and Fragrances – Laboratoire Monique Rémy (IFF-LMR Naturals), Parc Industriel des Bois de Grasse 18/20 avenue Joseph Honoré Isnard F-06130 Grasse, France; Université degli Studi di Torino, Dipartimento di Scienze Agrarie, Forestali e Alimentari, e Dipartimento di Scienze Della Vita e Biologia dei Sistemi, Torino, Italy
杂志
Plant Physiology and Biochemistry（2018）
DOI
10.1016/j.plaphy.2018.03.009
所属领域
代谢工程
关键词
(+)-(3S)-linalool(-)-(3R)-linaloolFlower fragranceMonoterpene biosynthesis pathwaysRosa chinensisTerpene synthasesnerolidol
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解决的核心问题

玫瑰花朵中芳樟醇含量低的原因是什么？传统萜烯合酶（TPS）途径与Nudix途径在玫瑰单萜生物合成中的相对贡献如何？

研究策略

利用玫瑰EST文库筛选单萜合酶同源序列，通过基因组步移和RT-PCR克隆全长cDNA；在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，进行体外酶活测定和手性产物分析；通过定量RT-PCR分析基因表达水平；在烟草叶片中瞬时表达验证体内活性，并用GFP融合进行亚细胞定位；比较不同品种和发育阶段的芳樟醇积累与基因表达。

研究路线图

100%
玫瑰芳樟醇含量低的成因？TPS与Nudix途径各自贡献？
EST筛选+基因组步移+RT-PCR克隆全长cDNA；大肠杆菌异源表达纯化；体外活性与手性分析；qRT-PCR；烟草瞬时表达与GFP定位
克隆4个TPS基因（RcLINS、RcLIN-NERS1/2/3）；RcLIN-NERS3为假基因；RcLINS为专一(-)-(3R)-芳樟醇合酶，NERS1/2为双功能(+)-(3S)-芳樟醇/橙花叔醇合酶
TPS基因表达极低：RcLINS/RcNERS1/RcNERS2的RPKM为150/70/60，较RhNUDX1低240-600倍；RcLINS定位于质体表面囊泡而非基质
'Lady Hillingdon'花瓣芳樟醇最高34.3 ng/mg DW；'The McCartney rose'中香叶醇类（Nudix产物）为1857 ng/mg，是芳樟醇的82倍；仅检出(-)-(3R)-芳樟醇，无橙花叔醇
TPS基因表达极低是芳樟醇含量低的主因；玫瑰单萜合成主要由Nudix途径（RhNUDX1）驱动，TPS贡献甚微
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核心内容

该研究从玫瑰EST文库中筛选并克隆了四个芳樟醇/橙花叔醇合酶基因，其中RcLIN-NERS3为假基因。体外酶活测定表明，RcLINS是专一性的(-)-(3R)-芳樟醇合酶，而RcLIN-NERS1和RcLIN-NERS2为双功能(+)-(3S)-芳樟醇/橙花叔醇合酶。通过定量RT-PCR发现，这些TPS基因在花序中的表达量极低，RPKM值仅60至150，比RhNUDX1（36034）低240至600倍。在‘Lady Hillingdon’品种阶段3花瓣中，芳樟醇含量最高达34.3 ng/mg干重，而‘The McCartney rose’阶段4花瓣中Nudix途径的香叶醇及衍生物含量为1857 ng/mg干重，约为游离芳樟醇的82倍。所有检测样品仅产生(-)-(3R)-芳樟醇异构体，未检测到橙花叔醇。亚细胞定位显示RcLINS定位于质体表面囊泡而非质体基质。结果表明，玫瑰中传统TPS途径对单萜合成的贡献远低于Nudix途径，TPS基因极低表达是芳樟醇含量低的主要原因，玫瑰单萜生物合成主要由RhNUDX1驱动的Nudix途径主导。

创新点

首次在玫瑰中克隆并功能表征了多个芳樟醇/橙花叔醇合酶，发现只有单一的(-)-(3R)-芳樟醇合酶（RcLINS）参与体内芳樟醇合成；揭示了这些TPS基因极低表达量是芳樟醇含量低的主要原因；提出玫瑰单萜生物合成主要由Nudix途径驱动，而非传统TPS途径。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS 单萜生物合成（MEP途径→GPP→芳樟醇） RcLINS RcLINS 催化 专一的(-)-(3R)-芳樟醇合酶，TPS-b亚家族，定位于质体
Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS 单萜/倍半萜生物合成（GPP→芳樟醇，FPP→橙花叔醇） RcLIN-NERS1 RcLIN-NERS1 催化 双功能(+)-(3S)-芳樟醇/橙花叔醇合酶，TPS-g亚家族，可能定位于胞质
Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS 单萜/倍半萜生物合成（GPP→芳樟醇，FPP→橙花叔醇） RcLIN-NERS2 RcLIN-NERS2 催化 双功能(+)-(3S)-芳樟醇/橙花叔醇合酶，TPS-g亚家族，存在截短型与全长型
Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS 单萜/倍半萜生物合成 RcLIN-NERS3 RcLIN-NERS3 催化 假基因，缺乏5'端大部分序列，预计无TPS活性
Rosa chinensis 'Old Blush' Nudix途径（GPP→香叶醇） RhNUDX1 RhNUDX1 催化 Nudix水解酶，将GPP去磷酸化为GP，K_m为140 nM，在花瓣中高表达
Nicotiana benthamiana 单萜生物合成 RcLINS RcLINS 催化 瞬时表达验证体内产生芳樟醇，GFP融合显示定位于质体表面囊泡状结构

关键发现

  1. 在玫瑰EST文库中仅筛到4个单萜合酶相关序列，其中RcLIN-NERS3为假基因
  2. RcLINS是专一的(-)-(3R)-芳樟醇合酶，RcLIN-NERS1和RcLIN-NERS2是双功能(+)-(3S)-芳樟醇/橙花叔醇合酶
  3. RcLINS、RcLIN-NERS1、RcLIN-NERS2在花序中的RPKM值分别为150、70和60，而RhNUDX1为36034，Germacrene D合酶为4256，即TPS表达量比RhNUDX1低240-600倍，比Germacrene D合酶低30-70倍
  4. 'Lady Hillingdon'阶段3花瓣中芳樟醇含量最高达34.3±1.5 ng/mg干重
  5. 'The McCartney rose'阶段4花瓣中Nudix途径产物（香叶醇及衍生物）为1857±119.8 ng/mg干重，约为游离芳樟醇（22.7±6.1 ng/mg）的82倍
  6. 所有检测到的玫瑰样品只产生(-)-(3R)-芳樟醇异构体，未检测到橙花叔醇
  7. RcLINS定位于质体表面囊泡状结构，而非质体基质。

研究结论

玫瑰基因组中至少存在4个芳樟醇/芳樟醇-橙花叔醇合酶基因，但由于这些TPS基因表达极低，导致芳樟醇在玫瑰花香中仅是次要成分。玫瑰的单萜生物合成主要依赖于Nudix途径（RhNUDX1）产生香叶醇及其衍生物，传统TPS途径贡献很小。