Yeast metabolic engineering - Targeting sterol metabolism and terpenoid formation
- 作者
- Tamara Wriessnegger, Harald Pichler
- 单位
- ACIB - Austrian Centre of Industrial Biotechnology, Graz, Austria; Institute of Molecular Biotechnology, Graz University of Technology, Austria
- 杂志
- Progress in Lipid Research（2013）
- DOI
- 10.1016/j.plipres.2013.03.001
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何通过改造酵母甾醇代谢途径（甲羟戊酸途径）来生产高价值萜类化合物，并阐明甾醇结构与膜蛋白功能之间的关系。
研究策略
综述了酵母甾醇代谢工程的研究策略，包括敲除或下调ERG基因（如ERG9）、过表达tHMG1等限速酶、异源表达胆固醇合成酶（DHCR7/DHCR24）及植物萜类合酶、调控甾醇转运和乙酰辅酶A供给等，以实现甾醇、类固醇激素及各类萜烯的生产。
核心内容
该综述聚焦于通过代谢工程改造酿酒酵母甾醇生物合成途径，以实现高价值萜类化合物的生产，并探讨甾醇结构与膜蛋白功能的关系。研究系统总结了靶向甲羟戊酸途径的策略，包括下调ERG9基因以分流代谢流、过表达限速酶tHMG1、异源表达胆固醇合成酶（如斑马鱼DHCR7和DHCR24）及植物萜类合酶，同时调控甾醇转运和乙酰辅酶A供给。关键结果显示，在erg5Δerg6Δ菌株中表达DHCR7和DHCR24后，总甾醇中胆固醇占比高达96%；过表达tHMG1、ERG1和ERG11可提升麦角固醇积累，且发酵液乙醇浓度增至15%时麦角固醇和角鲨烯显著积累。在工程酵母中amorpha-4,11-diene产量超过40 g/L，ERG20 K197E突变则使菌株分泌香叶醇和芳樟醇。此外，通过整合13个工程基因（包括CYP11A1、ADX、CYP11B1、3β-HSD等），实现了从简单碳源直接合成氢化可的松。研究还发现胆固醇替代麦角固醇会使Pdr12p活性丧失，但Can1p和Tat2p功能不受影响，而erg2Δ、erg3Δ、erg6Δ突变可改变膜流动性和通透性。这些成果表明，酵母甾醇途径高度可塑，既为多种高价值萜类（如甾体激素、单萜、倍半萜、类胡萝卜素）的异源生产提供了高效平台，也为解析甾醇-膜蛋白相互作用机制奠定了基础。
创新点
系统总结了甾醇工程酵母在基础研究（甾醇-膜蛋白相互作用）和应用（非动物源胆固醇、甾体激素、单萜/倍半萜/二萜/类胡萝卜素）中的进展，并列举了关键基因操作和工程策略。
研究对象（25）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | HMG1/HMG2 | Hmg1p/Hmg2p | 催化 | 过表达截短型tHMG1增强甾醇和萜类前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG9 | Erg9p | 催化 | 下调或破坏ERG9使FPP流向萜类合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG1 | Erg1p | 催化 | 角鲨烯环氧化酶，过表达促进麦角固醇积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG11 | Erg11p | 催化 | C-14脱甲基酶，过表达提高麦角固醇含量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG4 | Erg4p | 催化 | C-24(28)还原酶，缺失影响交配和shmoo形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG5 | Erg5p | 催化 | C-22脱饱和酶，与ERG6双缺失用于胆固醇生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG6 | Erg6p | 催化 | C-24甾醇甲基转移酶，缺失导致累积非典型甾醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG2 | Erg2p | 催化 | C-8甾醇异构酶，影响膜通透性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG24 | Erg24p | 催化 | C-14还原酶，缺失导致MAS积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG25 | Erg25p | 催化 | C-4甲基甾醇氧化酶，与ERG24双缺失产生FF-MAS |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类合成 | ERG20 | Erg20p | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，突变K197E可分泌香叶醇和芳樟醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类合成 | BTS1 | Bts1p | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，用于二萜合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类合成 | DPP1 | Dpp1p | 催化 | 异戊二烯磷酸磷酸酶，敲除以减少FPP去磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A代谢 | ALD6, SeACS | 醛脱氢酶, 乙酰辅酶A合酶 | 催化 | 同时过表达增加乙酰辅酶A供给，提高萜类产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇摄取/转运 | AUS1, PDR11 | Aus1p, Pdr11p | 转运 | ABC转运体参与厌氧条件下外源甾醇摄取 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | SMT1/ERG6 | Erg6p | 催化 | 定点突变可改变C1转移活性，合成植物甾醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 胆固醇合成 | DHCR7, DHCR24 | Dhrc7p, Dhrc24p | 催化 | 来自斑马鱼，在erg5Δerg6Δ中表达使胆固醇占总甾醇96% |
| Saccharomyces cerevisiae | 类固醇合成 | CYP11A1, ADX, ADR, CYP11B1, 3β-HSD, CYP17A1, CYP21A1, ARH1 | 细胞色素P450酶及电子传递蛋白 | 催化 | 13个工程基因实现从简单碳源合成氢化可的松 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜合成 | GES (Ocimum basilicum) | 香叶醇合酶 | 催化 | 与ERG20突变共表达提高香叶醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜合成 | ADS, CYP71AV1 | 紫穗槐二烯合酶, 紫穗槐二烯氧化酶 | 催化 | 结合tHMG1过表达和ERG9下调，amorphadiene产量>40 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜合成 | TXS (taxadiene synthase) | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 用于紫杉醇前体生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成 | carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素合成酶 | 催化 | 表达后生产β-胡萝卜素、番茄红素等 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇调控 | UPC2, ECM22 | Upc2p, Ecm22p | 调控 | 转录因子，调控甾醇合成相关基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | 膜蛋白转运 | CAN1, TAT2 | Can1p, Tat2p | 转运 | 精氨酸和色氨酸通透酶，甾醇替代不影响其功能 |
| Saccharomyces cerevisiae | 膜蛋白转运 | PDR12 | Pdr12p | 转运 | ABC转运体，活性依赖麦角固醇，胆固醇替代后失活 |
关键发现
- 通过表达斑马鱼DHCR7和DHCR24，erg5Δerg6Δ菌株的总甾醇中胆固醇占96%
- 野生型酵母麦角固醇含量约为细胞干重的0.6%，过表达tHMG1、ERG1和ERG11可提高麦角固醇积累，发酵液中乙醇浓度增至15%导致麦角固醇和角鲨烯积累
- 在工程酵母中amorpha-4,11-diene产量>40 g/L
- ERG20 K197E突变导致分泌香叶醇和芳樟醇，且合成更长的多萜醇
- 胆固醇替代麦角固醇使Pdr12p活性丧失，但Can1p和Tat2p功能不受影响
- 通过13个工程基因（包括CYP11A1、ADX、ADR、CYP11B1、3β-HSD、CYP17A1、CYP21A1等）使酿酒酵母从简单碳源合成氢化可的松
- erg2Δ、erg3Δ、erg6Δ突变影响膜流动性和通透性。
研究结论
酵母甾醇生物合成途径高度保守且易于遗传操作，通过代谢工程可实现多种高价值萜类化合物（甾醇、类固醇激素、单萜、倍半萜、二萜和类胡萝卜素）的异源生产，并为研究甾醇-膜蛋白相互作用提供有力工具。