Thermophilic ethanologenes: future prospects for second-generation bioethanol production
- 作者
- Mark P. Taylor, Kirsten L. Eley, Steve Martin, Marla I. Tuffin, Stephanie G. Burton, Donald A. Cowan
- 单位
- TMO Renewables Ltd, Guildford, Surrey, GU2 7YF, UK; Institute for Microbial Biotechnology and Metagenomics (IMBM), University of the Western Cape, Cape Town, 7535, South Africa; Department of Chemical Engineering, University of Cape Town, Cape Town, 7011, South Africa
- 杂志
- Trends in Biotechnology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.tibtech.2009.03.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发能够高效利用木质纤维素水解液中五碳糖和六碳糖、且具备高温发酵优势的工程化嗜热产乙醇菌株，以克服第二代生物乙醇生产中产率低、乙醇耐受性差和遗传工具缺乏等障碍。
研究策略
通过基因敲除（如ldh、pfl、ak/pta）和基因上调（如pdh）等手段改造嗜热菌的代谢网络，使碳通量流向乙醇；同时发展细胞转化、基因缺失和基因上调的可靠方法，并比较不同工程菌株在混合糖底物上的乙醇产率。
核心内容
该研究系统总结了嗜热产乙醇菌株在第二代生物乙醇生产中的应用前景，重点讨论了通过代谢工程改造嗜热菌以高效利用木质纤维素水解液中的五碳糖和六碳糖。研究者采用基因敲除（如ldh、pfl、ak/pta）和基因上调（如pdh）等手段重塑碳通量流向乙醇，并在Clostridium、Thermoanaerobacter和Geobacillus等属中发展了电转化、基因缺失等遗传工具。关键结果包括：C. thermocellum的ldh突变株在pH 6.5时产乙醇约12.5 g/L，远高于亲本菌株的5 g/L，乙醇耐受性提高至4% v/v；T. saccharolyticum ALK2在连续培养150代后保持稳定的同型乙醇发酵表型，最大乙醇滴度达37 g/L，产率为0.38 g/g总糖；G. thermoglucosidasius TM242在混合糖底物上产率为0.41–0.44 g/g，接近理论值。此外，部分工程菌株可耐受8–15% v/v乙醇。这些结果表明，系统代谢工程改造与遗传工具进步已使嗜热菌在高温下高效转化混合糖成为可能，兼具产物回收节能和抗污染优势，是第二代生物乙醇商业化的重要方向。
创新点
1. 总结嗜热菌在高温发酵、产品回收、抗污染等方面的过程优势；2. 报道了电转化、基因敲除等遗传工具在Clostridium、Thermoanaerobacter和Geobacillus等嗜热菌中的成功应用；3. 工程菌株TM242、ALK2、BG1L1等实现接近理论产率的乙醇生产，并推动了TMO Renewables、Mascoma、Biogasol等公司的成立。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Geobacillus thermoglucosidasius TM242 | 糖酵解/丙酮酸代谢/乙醇发酵 | ldh, pfl, pdh | 乳酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶 | 催化 | Δldh、Δpfl、pdh上调，葡萄糖产率0.41-0.44 g/g，木糖+葡萄糖产率0.44 g/g |
| Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 | 糖酵解/混合酸发酵 | ldh, ak, pta | 乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶 | 催化 | Δldh Δak Δpta，最大乙醇滴度37 g/L，产率0.38 g/g |
| Thermoanaerobacter mathranii BG1L1 | 糖酵解/乙醇发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 | 催化 | Δldh，在玉米秸秆和麦秆水解液中产率0.39-0.42 g/g总糖 |
| Clostridium thermocellum | 纤维素降解/糖酵解 | ldh | 乳酸脱氢酶、纤维素酶（cellulosome） | 催化 | ldh突变株产乙醇约12.5 g/L，亲本5 g/L；乙醇耐受突变株C9耐受2.5% v/v乙醇 |
| Thermoanaerobacter ethanolicus | 乙醇发酵 | adhA, adhB | 乙醇脱氢酶A、乙醇脱氢酶B | 催化 | AdhB介导乙醇产生，AdhA与乙醇耐受相关；工程菌株可耐受8% v/v乙醇 |
| Geobacillus stearothermophilus | 混合酸发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 | 催化 | ldh缺失变异株曾被分离，但稳定性存疑 |
| Zymomonas mobilis | Entner-Doudoroff途径/乙醇发酵 | pdc, adh | 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶 | 催化 | 作为基因供体，pdc在G. thermoglucosidasius中异源表达，活性保留至52°C |
| Escherichia coli / Klebsiella oxytoca | 糖酵解/乙醇发酵 | pdc, adh | 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶 | 催化 | 异源表达Z. mobilis的pdc和adh基因，实现木质纤维原料生产乙醇 |
关键发现
- ['C. thermocellum的ldh突变株在pH 6.5时产乙醇约12.5 g/L，亲本菌株仅5 g/L，且乙醇耐受性提高到4% v/v。', 'C. thermocellum乙醇耐受突变株C9可耐受2.5% v/v乙醇，而野生型仅耐受0.5% v/v。', 'T. saccharolyticum ALK2（Δak Δldh）在连续培养150代后仍保持稳定的同型乙醇发酵表型，最大乙醇滴度达37 g/L，在混合纯糖上产率为0.38 g/g总糖。', 'T. mathranii BG1L1（Δldh）在玉米秸秆水解液和麦秆水解液中乙醇产率为0.39-0.42 g/g总糖。', 'G. thermoglucosidasius TM242（Δldh Δpfl pdh上调）以D-葡萄糖为底物乙醇产率为0.41-0.44 g/g
- 以D-木糖和D-葡萄糖为底物产率为0.44 g/g
- TM42（Δldh pdh上调）在D-木糖、D-葡萄糖和L-阿拉伯糖上产率为0.41 g/g。', 'C. thermocellum与T. ethanolicus共培养时，每摩尔纤维素无水葡萄糖单位可产1.8摩尔乙醇。', 'C. thermocellum电转化效率达到10^5转化子/μg DNA。', 'Thermoanaerobacter ethanolicus工程菌株可在8% v/v乙醇中存活并复制
- G. thermoglucosidasius M10EXG可耐受10% v/v乙醇
- Anoxybacillus sp. WP06可耐受15% v/v乙醇。', 'Z. mobilis的pdc基因在G. thermoglucosidasius中功能表达，酶活性在52°C下保留，但在54°C以上丧失。']
研究结论
嗜热产乙醇菌株通过系统的代谢工程改造（敲除副产物途径、上调乙醇关键酶）和日益完善的遗传工具，能够在高温下高效利用木质纤维素中的混合糖生产乙醇，产率接近理论值，并具备过程节能、减少污染等优势，是第二代生物乙醇商业化的重要发展方向。