Carotenoid production and phenotypic variation in Azospirillum brasilense
- 作者
- Gal Reem Brenholtz, Dafna Tamir-Ariel, Yaacov Okon, Saul Burdman
- 单位
- Department of Plant Pathology and Microbiology, The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, Rehovot 76100 Israel
- 杂志
- Research in Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.resmic.2017.02.008
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
评估巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）在丰富培养基中生长时发生表型变异（菌落色素改变和胞外多糖过量产生）的频率，并解析其遗传基础，特别是类胡萝卜素合成调控相关基因的突变。
研究策略
对A. brasilense菌株Sp7、Cd、Sp245、Az39和phv2在LB丰富培养基中培养后，筛选菌落色素或胞外多糖改变的表型变体；对Sp7粉红色变体的chrR1和rpoE1基因进行PCR扩增和测序，并与菌株Cd的已知突变进行比较。
研究路线图
核心内容
该研究系统评估了巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）五个菌株在丰富培养基中的表型变异频率，并解析了类胡萝卜素合成调控的遗传基础。通过LB培养筛选菌落色素或胞外多糖改变的表型变体，对Sp7粉红色变体的chrR1和rpoE1基因进行PCR扩增和测序。结果显示，Sp7菌株白色变粉色的频率为0.009%–0.026%，Cd菌株粉色变白色的频率为0–0.008%，phv2菌株粘液增强变体频率最高仅0.003%，而Sp245和Az39未检测到任何变体。对28个Sp7粉红色变体的测序发现，全部携带chrR1基因突变，共鉴定出7种不同突变，其中chrR1_2（Cys36→Arg）最为常见，占53.6%；菌株Cd的chrR1基因则存在单核苷酸缺失导致移码。这些结果证实ChrR1是类胡萝卜素合成的关键负调控因子，其突变导致RpoE1组成型激活而过量产生类胡萝卜素。表型变异具有菌株和环境依赖性，稳定性更高的Sp245和Az39更适合作为商业接种剂的生产菌株。
创新点
首次系统比较了五种A. brasilense菌株在丰富培养条件下的表型变异频率；发现所有Sp7粉红色变体均携带chrR1基因突变，揭示chrR1存在多个突变热点；为菌株稳定性评价和接种剂生产提供理论依据。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | chrR1 | ChrR1 | 调控 | 抗σ因子，负调控类胡萝卜素合成；粉红色表型变体中检测到7种突变，包括错义、插入和缺失。 |
| Azospirillum brasilense Cd | 类胡萝卜素生物合成 | chrR1 | ChrR1 | 调控 | 该菌株chrR1基因存在单碱基缺失（CDS第466位）导致移码，使RpoE1失控，产生高含量类胡萝卜素和粉色菌落。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | rpoE1 | RpoE1 | 调控 | ECF σ因子，与ChrR1拮抗调控类胡萝卜素基因转录；Sp7中功能正常，Cd中因ChrR1失活而组成型激活。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | rpoE2 | RpoE2 | 调控 | 组成型表达的ECF σ因子，与ChrR2配对，参与氧化胁迫响应。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | chrR2 | ChrR2 | 调控 | 与RpoE2组成型表达的anti-σ因子，抑制RpoE2活性。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE2 | CrtE2 | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶，催化法尼基焦磷酸转化为GGPP，是类胡萝卜素合成的关键步骤，受RpoH2/RpoH1调控。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE1 | CrtE1 | 催化 | 第二个GGPP合酶同源物，也受RpoE1间接调控，但具体σ因子未知。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | rpoH1 | RpoH1 | 调控 | 热激σ因子，被RpoE2激活，进而促进crtE1转录，参与类胡萝卜素合成调控网络。 |
| Azospirillum brasilense Sp7 | 类胡萝卜素生物合成 | rpoH2 | RpoH2 | 调控 | 热激σ因子，被RpoE1激活，促进crtE2转录，参与光氧化胁迫响应和类胡萝卜素合成。 |
| Azospirillum brasilense phv2 | 胞外多糖生物合成 | — | — | 调控 | phv2是Sp7的EPS过量产生型变体，EPS产量约8倍于Sp7，本研究中phv2又产生两个粘液增强变体（频率0-0.003%），但具体基因未鉴定。 |
关键发现
- Sp7菌株白色变粉色的频率为0.009%-0.026%（三个实验分别为0.009%、0.026%、0.009%）
- Cd菌株粉色变白色的频率为0-0.008%（分别为0、0.001%、0.008%）
- phv2菌株粘液增强变体的频率为0-0.003%（平均0.001%）
- Sp245和Az39未检测到任何表型变体。对28个Sp7粉红色变体测序，发现全部携带chrR1基因突变，共鉴定出7种不同突变（chrR1_1至chrR1_7），其中chrR1_2（Cys36→Arg）最为常见，出现在15/28个变体中（53.6%）。菌株Cd的chrR1基因存在一个单核苷酸缺失（CDS第466位），导致移码和提前终止。
研究结论
研究结果表明，A. brasilense的表型变异是菌株依赖和环境依赖的：在丰富培养基中，胞外多糖过量产生的变体极少出现（仅phv2产生），而色素改变变体主要出现在Sp7和Cd中。Sp7粉红色变体均因chrR1基因突变导致RpoE1组成型激活，进而过量产生类胡萝卜素，进一步证实ChrR1是类胡萝卜素合成的关键负调控因子。稳定菌株Sp245和Az39可能更适合作为商业接种剂生产菌株。