An engineered Pseudomonas putida can simultaneously degrade organophosphates, pyrethroids and carbamates
- 作者
- Ting Gong, Xiaoqing Xu, Yulei Dang, Annie Kong, Yunbo Wu, Peixin Liang, Shufang Wang, Huilei Yu, Ping Xu, Chao Yang
- 单位
- Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology for Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China; State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Nankai University, Tianjin 300071, China; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
- 杂志
- Science of the Total Environment（2018）
- DOI
- 10.1016/j.scitotenv.2018.02.143
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
自然微生物缺乏同时降解不同类型农药的能力，导致多种农药混合污染土壤难以原位生物修复。
研究策略
以生物安全菌株Pseudomonas putida KT2440为底盘，采用无标记（scarless）基因组编辑方法，将四个农药降解基因（mpd、pytH、mcd、cehA）以及vgb和gfp整合到染色体中，实现多种农药同步降解、增强低氧环境下的氧摄取能力和实时荧光监测。
核心内容
针对自然微生物难以同时降解多种农药的限制，该研究以生物安全菌株恶臭假单胞菌KT2440为底盘，采用无标记基因组编辑方法，将有机磷降解基因mpd、拟除虫菊酯降解基因pytH、氨基甲酸酯降解基因mcd和cehA，以及透明颤菌血红蛋白基因vgb和绿色荧光蛋白基因gfp整合至染色体。重组菌株KTUE在M9最小培养基中30小时内可完全降解50 mg/L的甲基对硫磷、毒死蜱、甲氰菊酯、氯氰菊酯、克百威和甲萘威六种农药；土壤修复实验中，以10⁶ cells/g接种后15天内完全去除土壤中每种50 mg/kg的上述农药。VHb的表达赋予KTUE在限氧条件下更强的生长能力，且连续传代50代后降解活性和荧光标记均稳定维持，而KTUE与对照菌株生长曲线相近，40小时内最大OD600分别为2.617和2.762。该菌株兼具广谱降解、低氧适应性和可追踪性，为多农药复合污染土壤的原位生物修复提供了理想候选。
创新点
1. 首次在P. putida KT2440中同时整合有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯三类农药降解基因，构建广谱降解菌；2. 引入透明颤菌血红蛋白（VHb）增强菌株在低氧环境中的氧摄取与竞争能力；3. 利用绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株，便于生物修复过程中实时追踪；4. 无痕插入不留下抗生素抗性标记，提高环境安全性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 | 有机磷降解 | mpd | 甲基对硫磷水解酶 (MPH) | 催化 | 水解甲基对硫磷、毒死蜱等有机磷农药 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 拟除虫菊酯降解 | pytH | 拟除虫菊酯水解羧酸酯酶 (PytH) | 催化 | 水解甲氰菊酯、氯氰菊酯等拟除虫菊酯 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 氨基甲酸酯降解 | mcd | 克百威水解酶 | 催化 | 水解克百威 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 氨基甲酸酯降解 | cehA | 甲萘威水解酶 | 催化 | 水解甲萘威 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 氧代谢 | vgb | 透明颤菌血红蛋白 (VHb) | 能量供给 | 促进氧向呼吸链传递，增强低氧条件下ATP生成和细胞生长 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 实时监测 | gfp | 绿色荧光蛋白 (GFP) | 调控 | 作为荧光报告蛋白，用于生物修复过程中菌株的实时追踪与监测 |
关键发现
重组菌株P. putida KTUE在含20 g/L葡萄糖的M9最小培养基中，30 h内可完全降解50 mg/L的甲基对硫磷、毒死蜱、甲氰菊酯、氯氰菊酯、克百威和甲萘威。土壤修复实验中，以10^6 cells/g接种KTUE后，15天内完全去除土壤中每种50 mg/kg的六种农药。VHb表达的KTUE在限氧条件下比不含VHb的KTUD生长更快。连续传代50代后，KTUE仍保持全部降解能力和绿色荧光。KTUE和KTU在40 h内生长曲线相似，28 h达到最大OD600分别为2.617和2.762。
研究结论
成功构建的P. putida KTUE可同时降解有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药，且具有增强的氧摄取和荧光标记能力，是原位生物修复多种农药污染土壤的理想候选菌株。