Production of Useful Terpenoids by Higher-Fungus Cell Factory and Synthetic Biology Approaches
- 作者
- Han Xiao, Jian-Jiang Zhong
- 杂志
- Trends in Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.tibtech.2015.12.007
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用高等真菌细胞工厂和合成生物学方法高效生产有用的萜类化合物，克服天然宿主遗传操作困难及异源宿主产物毒性等瓶颈。
研究策略
系统综述高等真菌萜类生物合成途径与基因操作工具（转化、过表达、缺失、RNAi），并结合内源发酵优化与异源合成生物学策略实现萜类生产。
核心内容
该文系统综述了高等真菌作为萜类化合物细胞工厂的合成生物学研究进展。作者归纳了灵芝、截短侧耳素产生菌等高等真菌的萜类生物合成途径及遗传操作工具，包括转化、过表达、基因缺失和RNAi，并比较了同源宿主与异源宿主（如酿酒酵母）生产萜类的优劣。文中总结了多种提升产量的组合策略：在灵芝中过表达HMGR使灵芝酸含量提高2倍达30.69 mg/g DCW；两阶段发酵使总灵芝酸达3.19 mg/100mg DCW，约为传统发酵的2.3倍；pH和溶氧移位补料发酵使灵芝酸产量达754.6 mg/l；化学诱变突变株使截短侧耳素产量提高67.4%，补料分批发酵最高达10.15 g/l。异源生产方面，青蒿酸在酿酒酵母中达25 g/l，原人参二醇达1189 mg/l，类胡萝卜素最高达1156 mg/l。作者提出“智能高等真菌细胞工厂”概念，指出未来需发展CRISPR-Cas等基因编辑工具并结合组学研究，以克服高等真菌遗传操作不成熟的瓶颈，推动其成为高效生产复杂萜类的可行平台。
创新点
首次系统提出“智能高等真菌细胞工厂”构建概念；比较了同源与异源宿主作为细胞工厂的优缺点；总结了多种提高萜类产量的组合策略。
研究对象（30）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成（甲羟戊酸通路） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达使灵芝酸含量提高2倍达30.69 mg/g DCW |
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成 | squalene synthase | 鲨烯合酶 | 催化 | 过表达使GA-MK、GA-T、GA-Me、GA-S分别达16、40、43、53 μg/100mg DCW，为野生型的2.86、2.67、1.95、1.25倍 |
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸生物合成 | CYP450s | 细胞色素P450酶 | 催化 | 负责灵芝酸骨架的后修饰，多数未知 |
| Clitopilus passeckerianus | 截短侧耳素生物合成 | CYP450 family 1 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 增强表达可提高截短侧耳素产量 |
| Hypholoma sublateritium | 克拉维酸和麦角固醇生物合成 | erg1 | 鲨烯环氧酶 | 催化 | RNAi敲低使erg1表达减少50%，克拉维酸产量降低 |
| Schizophyllum commune | DNA修复/同源重组 | ku80 | Ku80蛋白 | 调控 | 缺失提高同源重组效率，但转化效率降低100倍 |
| Coprinopsis cinerea | DNA修复/同源重组 | ku70 | Ku70蛋白 | 调控 | 失活提高基因打靶频率 |
| Omphalotus olearius | 鹅膏菌素（illudin）生物合成 | omp1, omp6, omp7 | 倍半萜合酶 | 催化 | 位于生物合成基因簇中，可能参与illudin合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿酸生物合成（甲羟戊酸通路） | CYP71AV1 | 紫穗槐二烯氧化酶 | 催化 | 来自青蒿，与CPR1共表达，结合发酵优化产青蒿酸25 g/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿酸生物合成 | CPR1 | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自青蒿，与CYP71AV1匹配 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿酸生物合成 | ALDH1 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 来自青蒿，推动青蒿酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿酸生物合成 | ADH1 | 醇脱氢酶 | 催化 | 来自青蒿，参与青蒿酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 原人参二醇生物合成 | dammarenediol II synthase | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 来自人参，与下游酶共表达产原人参二醇1189 mg/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 原人参二醇生物合成 | protopanaxadiol synthase | 原人参二醇合酶 | 催化 | 密码子优化，来自人参 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-香树脂醇生物合成 | β-amyrin synthase | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自甘草，结合tHMGR等产β-香树脂醇107 mg/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 人参皂苷CK合成 | UGTp1 | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 来自人参，将原人参二醇转化为CK，产量1.4 mg/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 人参皂苷Rh2合成 | UGTPg45 | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 来自人参，产Rh2 1.45 μmol/g DCW |
| Saccharomyces cerevisiae | 人参皂苷Rg3合成 | UGTPg29 | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 与UGTPg45共表达产Rg3 3.49 μmol/g DCW |
| Saccharomyces cerevisiae | 米尔特二烯生物合成 | SmCPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 来自丹参，与SmKSL融合，结合MOPE策略产365 mg/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 米尔特二烯生物合成 | SmKSL | 类贝壳杉烯合酶 | 催化 | 来自丹参，与SmCPS融合 |
| Saccharomyces cerevisiae | 米尔特二烯生物合成 | BTS1 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 与ERG20融合增强通量，结合tHMGRE等产488 mg/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 米尔特二烯生物合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 与BTS1融合 |
| Saccharomyces cerevisiae | 米尔特二烯生物合成 | tHMG1/tHMGRE | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达增强MVA通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁锈醇生物合成 | CYP76AH1 | 米尔替二烯氧化酶 | 催化 | 来自丹参，与植物CYP还原酶共表达产铁锈醇10.5 mg/l |
| Kluyveromyces marxianus | 类胡萝卜素生物合成 | β-carotene hydroxylase | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自藻类，产β-胡萝卜素244.7 μg/g DCW |
| Saccharomyces cerevisiae | β-胡萝卜素生物合成 | GAL10-GAL1 bidirectional promoters | — | 调控 | 用于可控组装和表达β-胡萝卜素通路，产7.41 mg/g DCW |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成 | carotenoid pathway genes | 类胡萝卜素合成酶系 | 催化 | 采用葡萄糖浓度顺序调控，产类胡萝卜素1156 mg/l（20.79 mg/g DCW） |
| Pseudomonas putida | 香叶酸生物合成（甲羟戊酸通路） | MVA pathway genes from Myxococcus xanthus | 甲羟戊酸通路酶系 | 催化 | 引入异源MVA通路，产香叶酸193 mg/l |
| Escherichia coli | 柠檬烯生物合成（甲羟戊酸通路） | nine MVA pathway genes | 甲羟戊酸通路酶系 | 催化 | 利用PCAP优化表达，产柠檬烯605 mg/l |
| Nicotiana benthamiana | 裂环环烯醚萜/异胡豆苷生物合成 | eight seco-iridoid pathway genes | 裂环环烯醚萜合酶等 | 催化 | 重组表达八基因实现异胡豆苷异源生产 |
关键发现
- 过表达HMGR使灵芝酸含量提高2倍达30.69 mg/g DCW；过表达鲨烯合酶使GA-MK-T-Me-S分别达到16、40、43、53 μg/100mg DCW，为野生型的2.86、2.67、1.95、1.25倍；两阶段发酵总灵芝酸达3.19 mg/100mg DCW（传统发酵仅1.36 mg/100mg DCW）；pH和DOT位移补料发酵灵芝酸达754.6 mg/l；10 mM Ca2+添加使总灵芝酸、GA-MK、GA-T、GA-S、GA-Me分别达71.12、1.91、11.94、2.33、3.03 mg/g DCW；三阶段光照策略灵芝酸产量达466.3 mg/l；化学诱变突变株Cp76的截短侧耳素产量提高67.4%；P. mutilis补料分批发酵截短侧耳素达10.15 g/l，产率0.053 g/l/h；异源生产中青蒿酸在S. cerevisiae中达25 g/l，柠檬烯605 mg/l，香叶酸193 mg/l，米尔特二烯365 mg/l和488 mg/l，铁锈醇10.5 mg/l，β-香树脂醇107 mg/l，原人参二醇1189 mg/l，人参皂苷CK
- 4 mg/l，Rh2
- 45 μmol/g DCW，Rg3
- 49 μmol/g DCW，β-胡萝卜素244.7 μg/g DCW（K. marxianus）和7.41 mg/g DCW（S. cerevisiae），类胡萝卜素1156 mg/l（20.79 mg/g DCW）。
研究结论
高等真菌是天然萜类的宝贵来源，但遗传操作仍不成熟；异源合成生物学虽可高效生产多种萜类，但商业化成功案例有限；未来需发展CRISPR-Cas等基因编辑工具，结合组学研究，构建智能高等真菌细胞工厂。