MEP pathway products allosterically promote monomerization of deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase to feedback-regulate their supply
- 作者
- Xueni Di, David Ortega-Alarcon, Ramu Kakumanu, Javier Iglesias-Fernandez, Lucia Diaz, Edward E.K. Baidoo, Adrian Velazquez-Campoy, Manuel Rodriguez-Concepcion, Jordi Perez-Gil
- 单位
- Institute for Plant Molecular and Cell Biology (IBMCP), CSIC-Universitat Politecnica de Valencia, 46022 Valencia, Spain; Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG), CSIC-IRTA-UAB-UB, Campus UAB Bellaterra, 08193 Barcelona, Spain; Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems (BIFI), Joint Unit GbSC-CSIC-BIFI, Universidad de Zaragoza, 50009 Zaragoza, Spain; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, 50009 Zaragoza, Spain; Joint BioEnergy Institute, 5885 Hollis Street, Emeryville, CA 94608, USA; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Nostrum Biodiscovery SL, 08029 Barcelona, Spain; Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS Aragon), 50009 Zaragoza, Spain; Centro de Investigación Biomédica en Red en el Área Temática de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), 28029 Madrid, Spain
- 杂志
- Plant Communications（2023）
- DOI
- 10.1016/j.xplc.2022.100512
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明MEP途径产物IPP和DMAPP反馈抑制DXS活性的分子机制，尤其是其是否通过别构效应调控DXS二聚体-单体状态。
研究策略
结合等温滴定量热法(ITC)、动态光散射(DLS)、分子对接模拟和体内免疫印迹分析，在细菌和植物系统中研究IPP/DMAPP与DXS的相互作用及其对DXS寡聚状态的影响。
核心内容
该研究揭示了MEP途径关键酶DXS受产物反馈抑制的分子机制。通过等温滴定量热法、动态光散射、分子对接和体内免疫印迹分析，发现IPP和DMAPP并非像传统认识那样竞争TPP活性位点，而是结合于DXS单体互作区的别构位点，直接促进酶从有活性的二聚体解离为无活性的单体。ITC显示番茄SlDXS1与IPP和DMAPP的解离常数分别为2.2 μM和1.7 μM，且在TPP存在下仍可结合，证实存在独立的别构位点。分子对接预测IPP和DMAPP与单体互作区的结合能分别为-6.57和-7.01 kcal/mol，而TPP结合于活性位点。体内实验表明，大肠杆菌和烟草中高浓度IPP/DMAPP均导致DXS二聚体/单体比降低、不溶性聚集体增加；烟草中抑制类胡萝卜素合成使DXP降至5.73 pg/mg，促进合成则升至641.99 pg/mg，直观验证了产物的反馈抑制效应。该机制在细菌和植物中保守，为异戊二烯代谢工程提供了新的调控靶点。
创新点
首次揭示IPP/DMAPP通过结合DXS单体互作区的别构位点促进酶单体化，而非传统的竞争TPP活性位点机制；并证明该机制在细菌和植物中保守。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (EcAB4-10, EcAM5-1) | MEP pathway | dxs | EcDxs (deoxyxylulose 5-phosphate synthase) | 催化 | MEP途径第一个限速酶，催化DXP合成，受IPP/DMAPP变构抑制 |
| Escherichia coli (EcAB4-10) | MEP pathway | dxr | DXR (DXP reductoisomerase) | 催化 | MEP途径第二个酶，在EcAB4-10中缺失，用于通过MVA补充生长 |
| Escherichia coli | MVA pathway (synthetic operon) | MVA operon genes | MVA pathway enzymes | 催化 | 将外源甲羟戊酸转化为IPP/DMAPP，用于调节体内代谢物水平 |
| Nicotiana benthamiana | MEP pathway | SIDXS1 | SlDXS1 | 催化 | 番茄来源的DXS异构体，在烟草叶片中异源表达，研究其单体化与聚集 |
| Nicotiana benthamiana | MEP pathway | SIDXS1-GFP | SlDXS1-GFP | 催化 | 用于亚细胞定位和聚集斑点定量，随IPP/DMAPP水平变化 |
| Escherichia coli / Nicotiana benthamiana | 蛋白质质量控制 | clpP/clpX | Clp protease complex | 调控 | 降解聚集的DXS单体，在持续高IPP/DMAPP时发挥作用 |
关键发现
- ITC实验表明，IPP和DMAPP与番茄SlDXS1直接结合，解离常数KD分别为2.2 μM和1.7 μM（TPP为4.2 μM），且在TPP存在下仍能结合（KD分别为1.2 μM和4.3 μM），提示存在独立于TPP活性位点的别构结合位点。分子对接预测IPP和DMAPP可结合于单体互作区（MIR），结合能分别为-6.57和-7.01 kcal/mol，而TPP在活性位点结合能为-13.49 kcal/mol。DLS显示，加入IPP或DMAPP后，SlDXS1的粒径从5.8 nm（约150 kDa二聚体）减小并出现更大颗粒，提示单体化及聚集。体内实验中，大肠杆菌EcAB4-10菌株在10 mM MVA下IPP/DMAPP升高而DXP降低
- EcAM5-1菌株中随MVA浓度增加，EcDxs和SlDXS1的二聚体/单体比降低、不溶性聚集体增加。在烟草叶片中，抑制类胡萝卜素合成的NF处理导致二聚体/单体比降低，而FSM处理则升高
- 代谢物定量显示NF使DXP降至5.73 pg/mg，而FSM使DXP升至641.99 pg/mg（对照7.69）。这些结果表明，高IPP/DMAPP促进DXS单体化与聚集，实现反馈抑制。
研究结论
本研究表明，DXS的活性受其产物IPP和DMAPP的别构反馈调控：产物结合到单体互作区促进二聚体解离为单体，导致酶失活；持续高浓度下单体进一步聚集并被Clp蛋白酶降解。该机制提供了快速适应产物需求变化的短期和长期调节，为微生物和植物异戊二烯代谢工程的理性设计提供了新靶点。