Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in E. coli
- 作者
- Luke Z. Yuan, Pierre E. Rouvière, Robert A. LaRossa, Wonchul Suh
- 单位
- DuPont Central Research and Development, Experimental Station, Wilmington, DE 19880, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2005）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2005.08.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中，通过染色体启动子工程而非多拷贝质粒过表达，增强异戊二烯途径通量以提高β-胡萝卜素产量，同时避免多拷贝质粒带来的代谢负担、分离不稳定性和基因调控困难。
研究策略
采用λ-Red重组系统进行PCR介导的染色体启动子替换，将强T5启动子整合到染色体异戊二烯基因上游，通过Flp/FRT系统去除选择标记；利用P1转导和混合噬菌体裂解液进行组合式基因堆叠，并通过黄色颜色筛选识别限速步骤，逐步解除通量瓶颈。
研究路线图
核心内容
该研究利用λ-Red重组系统在大肠杆菌染色体上对异戊二烯合成途径的多个基因进行启动子替换，以替代传统多拷贝质粒过表达策略，旨在增强代谢通量并提高β-胡萝卜素产量，同时避免质粒带来的代谢负担和分离不稳定性。通过单片段或双片段PCR介导的染色体整合及Flp/FRT标记切除，研究将强T5启动子逐个引入dxs、idi、ispDF、ispE和ispB等基因上游，并借助P1转导和混合裂解液实现组合式基因堆叠，依据黄色颜色筛选快速识别限速步骤。结果显示，单独过表达上述基因使β-胡萝卜素产量提升1.2至2.0倍；逐步堆叠后通量显著上升，最终组合菌株MG1655 P_T5-dxs P_T5-idi P_T5-ispB P_T5-ispDF(pDCQ108)的产量达6 mg/g细胞干重，较对照提高24.5倍，微阵列分析确认dxs、idi、ispD、ispF和ispB表达分别上调4、36、4、3和40倍。该研究证明了染色体启动子工程能有效解除内源代谢瓶颈，高产菌株可用于多种异戊二烯化合物的平台化生产，并意外发现ispB过表达有益于类胡萝卜素合成。
创新点
(1) 开发了单片段或双片段PCR介导的染色体启动子替换方法，可实现标记基因和启动子的直接整合及后续标记切除；(2) 建立了组合式P1转导，利用混合裂解液并行转移多个启动子工程基因，通过颜色筛选快速识别关键限速酶；(3) 意外发现ispB基因过表达（通常被认为分流碳流至醌合成）反而提高β-胡萝卜素产量。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 染色体启动子替换为P_T5，显著提高β-胡萝卜素产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 染色体启动子替换为P_T5，提高β-胡萝卜素产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispC | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 启动子替换为P_T5，但未显著提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispD | MEP胞苷转移酶 | 催化 | 与ispF共操纵子，启动子替换为P_T5后提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispE | MEP激酶 | 催化 | 启动子替换为P_T5，产量略有提高 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispF | MEC合酶 | 催化 | 与ispD共操纵子，启动子替换为P_T5后提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispG | HMBPP合酶 | 催化 | 启动子替换为P_T5，但未显著提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispH | HMBPP还原酶 | 催化 | 启动子替换为P_T5，但未显著提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 与dxs组成操纵子，构建P_T5-ispAdxs也提高产量 |
| E. coli MC1061 | DXP途径（异戊二烯生物合成） | ispB | 八异戊烯基二磷酸合酶 | 催化 | 意外发现启动子替换为P_T5后提高β-胡萝卜素产量 |
| E. coli MG1655（含pPCB15或pDCQ108质粒） | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素合成） | crtE | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 来自Pantoea stewartii，在质粒上表达，合成β-胡萝卜素 |
| E. coli MG1655（含pPCB15或pDCQ108质粒） | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素合成） | crtX | 类胡萝卜素葡萄糖基转移酶 | 催化 | 来自Pantoea stewartii，在质粒上表达，参与修饰 |
| E. coli MG1655（含pPCB15或pDCQ108质粒） | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素合成） | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自Pantoea stewartii，在质粒上表达，催化番茄红素环化 |
| E. coli MG1655（含pPCB15或pDCQ108质粒） | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素合成） | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Pantoea stewartii，在质粒上表达，催化脱氢 |
| E. coli MG1655（含pPCB15或pDCQ108质粒） | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素合成） | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Pantoea stewartii，在质粒上表达，催化两分子GGPP缩合 |
关键发现
- 通过染色体启动子替换，dxs、idi、ispDF、ispE、ispB的单独过表达使β-胡萝卜素分别增加2.0、1.4、1.4、1.2和1.3倍
- 组合工程菌株MG1655 P_T5-dxs P_T5-idi P_T5-ispB P_T5-ispDF(pDCQ108)的β-胡萝卜素产量达到6 mg/g细胞干重，较对照MG1655(pPCB15)提高24.5倍
- 逐步堆叠使β-胡萝卜素产量从3.3倍（仅P_T5-dxs）增至4倍（加入P_T5-idi）、4.5倍（再加入P_T5-ispB）、6.3倍（最后加入P_T5-ispDF）(基于OD450/OD600比值)
- 微阵列显示工程菌株中dxs、idi、ispD、ispF、ispB的表达分别提高4、36、4、3和40倍
- 高产菌株倍增时间(65 min)比对照(40 min)延长。
研究结论
通过染色体启动子替换和组合式P1转导，成功构建了高异戊二烯通量的大肠杆菌菌株，β-胡萝卜素产量达6 mg/g细胞干重，超过此前推测的非产类胡萝卜素大肠杆菌储存上限（1.6 mg/g）。该研究证明染色体启动子工程是提高内源代谢通量的有效策略，此高产菌株可作为生产多种类胡萝卜素及其他异戊二烯化合物的平台。