Coordinate expression of multiple bacterial carotenoid genes in canola leading to altered carotenoid production
- 作者
- Monica P. Ravanello, Dangyang Ke, Julie Alvarez, Bihua Huang, Christine K. Shewmaker
- 单位
- Monsanto Company, Calgene Campus, 1920 Fifth St, Davis, CA 95616, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2003）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2003.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
在油菜种子中，通过单独或组合表达细菌类胡萝卜素合成基因（crtB, crtE, crtI, crtY）和植物番茄红素β-环化酶，试图在不降低总类胡萝卜素含量的前提下，减少中间产物八氢番茄红素（phytoene）的积累，并提高β-胡萝卜素与α-胡萝卜素的比值。
研究策略
利用种子特异性启动子napin驱动，将细菌基因与豌豆Rubisco小亚基转运肽融合，靶向质体，在转基因油菜（Brassica napus）种子中分别表达crtB、crtB+crtE、crtB+crtI、crtB+crtY、crtB+植物β-环化酶以及crtB+crtI+crtY三基因组合，通过HPLC分析类胡萝卜素组成与含量，并用Western blot验证蛋白表达。
研究路线图
核心内容
本研究在油菜种子中系统比较了细菌类胡萝卜素合成基因不同组合的表达效果。利用种子特异性napin启动子驱动，将细菌crtB、crtE、crtI、crtY基因及植物番茄红素β-环化酶与Rubisco转运肽融合靶向质体，构建了单基因、双基因及三基因共表达的多组转基因植株，通过HPLC分析类胡萝卜素组成与含量。结果显示，单独表达crtB可使总类胡萝卜素较野生型提高约50倍，但八氢番茄红素积累明显，β/α-胡萝卜素比值为2:1；在crtB基础上共表达crtI可将八氢番茄红素占比从约13%降至约3.3%，降幅约90%，但对β/α比值无显著影响；共表达crtE或环化酶同样无法改变产物比例。只有同时表达crtB、crtI和crtY三个来自同一细菌的基因，才将β/α比值提高至约3.0–3.3，同时八氢番茄红素进一步降至约1.8%，总类胡萝卜素仍维持在578–1229 μg/gFW的高水平。该结果表明细菌类胡萝卜素酶可能通过形成多酶复合物实现底物通道化，协同表达多个同源基因才能有效重塑代谢产物组成，为后续类胡萝卜素下游产物的工程化改造提供了策略参考。
创新点
首次在油菜种子中系统比较了单个、双个和三个细菌类胡萝卜素基因协同表达的效果，发现只有同时表达crtB、crtI和crtY三个来自同一细菌的基因才能将β/α-胡萝卜素比值从2:1提高到3:1，并提出细菌酶可能形成多酶复合物通过底物通道化高效催化β-胡萝卜素合成。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Brassica napus (canola) 油菜种子 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | Phytoene synthase（八氢番茄红素合酶） | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化两分子GGPP缩合生成phytoene |
| Brassica napus (canola) 油菜种子 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | Geranylgeranyl diphosphate synthase（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶） | 催化 | 来自Erwinia uredovora，合成GGPP为类胡萝卜素前体 |
| Brassica napus (canola) 油菜种子 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | Phytoene desaturase（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化phytoene经多步脱氢生成lycopene |
| Brassica napus (canola) 油菜种子 | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | Lycopene cyclase（番茄红素环化酶） | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化lycopene环化生成β-胡萝卜素 |
| Brassica napus (canola) 油菜种子 | 类胡萝卜素生物合成 | lycopene β-cyclase（植物源） | Lycopene β-cyclase（番茄红素β-环化酶） | 催化 | 来自油菜内源，与细菌crtY功能相似，单独与crtB组合时未改变β/α比值 |
关键发现
- 单独表达crtB使总类胡萝卜素较野生型提高约50倍，β/α-胡萝卜素比值为2:1
- 在crtB基础上共表达crtI可使phytoene平均占比从约13%降至约3.3%（如crtB+crtI-1为3.6%，crtB+crtI-16为4.6%），降幅约90%，但β/α比值仍约为1.8-2
- 共表达crtE或环化酶（crtY或植物β-环化酶）对β/α比值无显著影响
- 三基因crtB+crtI+crtY共表达时，β/α比值提高至约3.0-3.3（如crtB+crtI+crtY-4为3.1，-15为3.3），同时phytoene含量进一步降低（如-4仅为18 μg/gFW，占1.8%），且总类胡萝卜素仍保持较高水平（约578-1229 μg/gFW）。
研究结论
在油菜种子中，仅表达crtB虽能大幅提高总类胡萝卜素，但要改变代谢产物组成（如提高β/α比）需要协同表达多个来自同一细菌的基因，其中crtB+crtI+crtY三基因组合最为有效。结果表明细菌类胡萝卜素酶可能形成多酶复合物，通过底物通道化实现有效代谢流，为后续工程化改造类胡萝卜素下游产物的组成提供了新策略。