Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol
- 作者
- Maria González-Pajuelo, Isabelle Meynial-Salles, Filipa Mendes, Jose Carlos Andrade, Isabel Vasconcelos, Philippe Soucaille
- 单位
- Escola Superior Biotecnologia, Universidade Catolica Portuguesa, Rua Dr. António Bernardino de Almeida, 4200-072 Porto, Portugal; CRT/CRITT-Bioindustries, INSA, 135 avenue de Rangueil, 31077 Toulouse cedex 4, France; Laboratoire de Biotechnologie-Bioprocedés, UMR INSA/CNRS 5504, UMR INSA/INRA 792, INSA, 135 avenue de Rangueil, 31077 Toulouse cedex 4. France
- 杂志
- Metabolic Engineering（2005）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2005.06.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种无需维生素B12的1,3-丙二醇（1,3-PD）工业化生产生物过程。天然高产菌Clostridium butyricum缺乏遗传操作工具，难以进行代谢工程改造，因此需要将C. butyricum中B12非依赖性的1,3-PD合成途径引入遗传工具成熟的C. acetobutylicum，以实现更高的1,3-PD滴度和生产率。
研究策略
将来源于C. butyricum的1,3-PD途径基因（dhaB1、dhaB2、dhaT）克隆至质粒pSPD5或pTLP中，并转化至C. acetobutylicum的不同突变株（ATCC 824、DG1、PJC4BK）中，通过筛选最佳重组菌株DG1(pSPD5)，进行补料分批和连续发酵，结合代谢通量分析评估其生理与生产性能。
研究路线图
核心内容
该研究针对1,3-丙二醇工业化生产中维生素B12依赖和高产菌株缺乏遗传工具的问题，将丁酸梭菌中B12非依赖的1,3-丙二醇合成途径基因（dhaB1、dhaB2、dhaT）克隆至质粒，转化入不同丙酮丁醇梭菌突变株，最终筛选出最优重组菌株DG1(pSPD5)。该菌株能以甘油为唯一碳源生长并生产1,3-丙二醇。补料分批培养中，47.5小时内消耗1797 mM甘油，1,3-丙二醇最高浓度达1104 mM，摩尔产率0.65 mol/mol甘油，体积生产率1.8 g/L/h，滴度和生产率分别约为天然生产菌丁酸梭菌的1.3倍和1.4倍；连续培养中（稀释率0.05 h⁻¹），1,3-丙二醇浓度达788 mM，生产率3 g/L/h，连续运行6个月质粒稳定且无需抗生素。该菌株还能直接利用生物柴油副产物粗甘油，性能与商业甘油相当。代谢通量分析显示甘油培养时1,3-丙二醇为主要产物，氢气生成极低，NAD(P)H主要来源于铁氧还蛋白还原。该研究首次在丙酮丁醇梭菌中实现B12非依赖途径的异源表达，获得的菌株在产量和生产率上超越天然生产菌，具备工业化应用潜力。
创新点
['首次在C. acetobutylicum中异源表达B12非依赖性的1,3-丙二醇途径，使其能够以甘油为唯一碳源生长并生产1,3-PD', '获得的重组菌株DG1(pSPD5)在1,3-PD滴度和生产率上均优于天然生产菌C. butyricum', '证明了该重组菌株可利用粗甘油（生物柴油副产物）进行生产，且性能与商业甘油相当', '连续培养6个月未添加抗生素，质粒稳定，菌株无退化']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum DG1 | 1,3-丙二醇生物合成途径 | dhaB1 | 甘油脱水酶（B12非依赖性）大亚基 | 催化 | 来自Clostridium butyricum，通过质粒pSPD5表达 |
| Clostridium acetobutylicum DG1 | 1,3-丙二醇生物合成途径 | dhaB2 | 甘油脱水酶（B12非依赖性）小亚基 | 催化 | 来自Clostridium butyricum，通过质粒pSPD5表达 |
| Clostridium acetobutylicum DG1 | 1,3-丙二醇生物合成途径 | dhaT | 1,3-丙二醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium butyricum，通过质粒pSPD5表达 |
| Clostridium acetobutylicum PJC4BK | 1,3-丙二醇生物合成途径 | dhaB1, dhaB2, dhaT | 甘油脱水酶（B12非依赖性）和1,3-丙二醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium butyricum，通过质粒pTLP表达（四环素抗性标记） |
| Clostridium acetobutylicum DG1 | 丁酸合成途径 | bk | 丁酸激酶 | 催化 | 试图通过基因敲除减少丁酸生成，但未获得正确重组菌株 |
关键发现
- 补料分批培养中，DG1(pSPD5)在47.5小时内消耗1797 mM甘油，产生1,3-PD最高浓度1104 mM，摩尔产率0.65 mol/mol甘油，体积生产率1.8 g/L/h，副产物为丁酸193 mM、乙酸67 mM、乳酸22 mM，无乙醇。在连续培养中（D=0.05 h^-1，pH
- 5），当甘油进料浓度为1303 mM时，1,3-PD浓度达788 mM，摩尔产率0.64 mol/mol，体积生产率3 g/L/h，且连续运行6个月保持稳定。相比之下，C. butyricum VPI 3266在补料分批中最高1,3-PD浓度为854 mM，体积生产率1.21 g/L/h；DG1(pSPD5)的滴度和生产率均显著更高（约1.3倍和1.4倍），但产率略低（0.65 vs
- 69）。使用粗甘油（65% w/v）连续培养时，1,3-PD浓度为391.6 mM，产率0.61 mol/mol，体积生产率1.49 g/L/h，与商业甘油无显著差异。在批次培养中，DG1(pSPD5)以109 mM甘油为底物时产72 mM 1,3-PD，产率0.66 mol/mol；ATCC 824(pSPD5)产67 mM，产率0.62；PJC4BK(pTLP)产58 mM，产率0.54。连续培养代谢通量分析显示，葡萄糖培养时主要产物为丁酸、乙酸和乳酸，氢气生成速率高（11.3 mmol/g/h）；甘油培养时1,3-PD成为主要产物，比生成速率15.08 mmol/g/h，氢气生成极低（<0.1 mmol/g/h），乙酸和乳酸生成显著减少，NAD(P)H主要来源于铁氧还蛋白还原。
研究结论
通过代谢工程将C. butyricum的B12非依赖性1,3-丙二醇途径引入C. acetobutylicum DG1，成功获得了能以甘油为底物高效生产1,3-PD的重组菌株DG1(pSPD5)。该菌株在1,3-PD浓度和生产率上超越天然生产菌C. butyricum，并可直接利用粗甘油，具有工业化应用潜力。虽然1,3-PD摩尔产率（0.65）略低于C. butyricum（0.69），但通过进一步优化代谢网络仍有望提高。此外，DG1中敲除丁酸激酶基因（bk）的尝试未获成功，揭示了该菌株在仅产乙酸时存在热力学限制，为后续菌株改造提供了重要理论依据。