Directed evolution of copy number of a broad host range plasmid for metabolic engineering
- 作者
- Luan Tao, Raymond E. Jackson, Qiong Cheng
- 单位
- Biological and Chemical Sciences and Engineering, Central Research and Development, E. I. DuPont de Nemours Inc., Experimental Station, E328/B48, Wilmington, DE 19880-0328, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2005）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2004.05.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
pBBR1广宿主质粒拷贝数较低，限制了外源基因的表达量，不利于代谢工程应用；需要定向进化以提高其拷贝数。
研究策略
以β-胡萝卜素为报告基因，对pBBR1广宿主质粒的复制控制区（rep基因及侧翼区）进行易错PCR随机突变，筛选深黄色高产菌落，并通过实时荧光定量PCR验证拷贝数变化，进一步与异戊二烯途径基因dxs共表达及在农杆菌中验证应用。
研究路线图
核心内容
该研究针对pBBR1广宿主质粒拷贝数较低、限制外源基因表达的问题，采用定向进化策略提高其拷贝数。以β-胡萝卜素为报告基因，对质粒复制控制区（rep基因及侧翼区）进行易错PCR随机突变，构建了超过10,000个克隆的突变体库，从中分离出约36个深黄色高产菌落。实时荧光定量PCR证实突变质粒在大肠杆菌中的拷贝数比亲本质粒提高3至7倍，测序鉴定出Rep蛋白S100L突变及rep起始密码子上游46 bp处的C3003T突变均可单独提高拷贝数。在代谢工程应用中，突变质粒与异戊二烯途径基因dxs共表达时β-胡萝卜素产量较亲本提高超过3.5倍，且与非大肠杆菌宿主农杆菌中的拷贝数提高1.7至3.8倍、产量提高1.6至2倍的结果一致。该研究首次将定向进化应用于广宿主质粒拷贝数改造，证明了提升质粒拷贝数可有效增强异源代谢产物合成，为不同细菌宿主中的代谢工程提供了一种通用工具。
创新点
['首次将定向进化策略应用于广宿主质粒拷贝数的提高；', '鉴定了rep基因S100L突变及上游C3003T突变可单独提高质粒拷贝数；', '证明了拷贝数提高的质粒在E. coli和非E. coli宿主（农杆菌）中均能提高β-胡萝卜素产量。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli XL1-blue MRF | 质粒复制 | rep | Rep复制起始蛋白 | 调控 | rep基因编码复制起始蛋白，其S100L突变（C3347T）导致质粒拷贝数提高3-7倍。 |
| Escherichia coli XL1-blue MRF | β-胡萝卜素生物合成 | crtE, crtYIB | CrtE、CrtY、CrtI、CrtB | 催化 | 源自Pantoea stewartii，作为报告基因，产物β-胡萝卜素用于筛选高拷贝突变体。 |
| Escherichia coli XL1-blue MRF | 异戊二烯（MEP）途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（Dxs） | 催化 | 源自Rhodococcus erythropolis AN12，与突变质粒共表达以增强类胡萝卜素前体供应。 |
| Agrobacterium tumefaciens C58 | 质粒复制 | rep | Rep复制起始蛋白 | 调控 | 验证突变质粒M2和M8在非大肠杆菌宿主中拷贝数提高1.7-3.8倍。 |
| Agrobacterium tumefaciens C58 | β-胡萝卜素生物合成 | crtE, crtYIB | CrtE、CrtY、CrtI、CrtB | 催化 | 在农杆菌中β-胡萝卜素产量提高1.6-2倍。 |
关键发现
- ['构建了超过10,000个克隆的突变体库，分离出约36个深黄色克隆，其中10个最高突变体的β-胡萝卜素产量比亲本提高2-3倍。', 'Real-time PCR证实突变质粒在大肠杆菌中的拷贝数比亲本质粒pDCQ318提高3-7倍。', '测序发现突变位于rep基因及其侧翼区
- 单突变C3347T（导致Rep蛋白S100L）或C3003T（rep起始密码子上游46 bp处的C→T）即可提高拷贝数。', '在E. coli中，突变质粒pDCQ318M1或pDCQ318M14与dxs共表达时β-胡萝卜素产量较pDCQ318亲本提高超过3.5倍，而单独表达dxs提高约2.5倍，表明二者具有微弱协同作用。', '在非大肠杆菌宿主A. tumefaciens C58中，突变质粒M2和M8的拷贝数较对照提高1.7-3.8倍，β-胡萝卜素产量提高1.6-2倍。']
研究结论
通过易错PCR定向进化成功提高了pBBR1广宿主质粒的拷贝数，突变位点定位于rep基因及上游调控区；拷贝数增加可增强异源β-胡萝卜素产量，且在不同细菌宿主中有效，为代谢工程提供了一种通用工具。